2.2.1动物细胞培养和核移植技术

动物细胞培养动物细胞融合生产单克隆抗体动物细胞核移植动物细胞工程常用技术其中动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础一、动物细胞培养1、动物细胞培养概念从动物机体中取出相关的，将它分散成，然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞。组织单个细胞生长和增殖动物胚胎或幼龄动物的组织、器官细胞生命力旺盛，分裂能力强使细胞和培养液充分接触原理：细胞增殖.1.为什么要把组织剪碎、用酶分解开？2.用什么酶？为什么？用胃蛋白酶行不行？3.胰蛋白酶会不会把细胞消化掉？4.为什么要再分装？5.什么是原代培养、传代培养？6.培养得到的细胞，如果暂时不用时，怎么保存？7.试说动物细胞培养的大致过程。2、动物细胞培养的过程请同学阅读P44－P46思考下列问题胚胎或幼龄动物的组织器官细胞悬液10代细胞50代细胞剪碎胰蛋白酶原代培养用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是蛋白质。动物细胞培养适宜的PH为7.2—7.4，此环境下胃蛋白酶（2.0）没有活性，而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性较高。比老龄动物的组织细胞增殖能力强，有丝分裂旺盛。分化程度越低，增殖能力越强，越容易培养。动物细胞培养不能最终培养成生物体细胞增殖缓慢，核型可能变化动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织和器官。贴壁生长接触抑制10代以内，保持正常二倍体核型传代培养2、动物细胞培养的过程无限传代细胞株细胞系胰蛋白酶除了可以消化细胞间的蛋白质外，长时间的作用也会消化细胞膜蛋白，对细胞有损伤作用，因此必须控制好胰蛋白酶的消化时间。1.胰蛋白酶真的不会把细胞消化掉吗？为什么？寻根问底①、细胞株：传代培养的细胞一般能传到10－50代，遗传物质没有发生改变。②细胞系：传代培养的细胞传到50代后，有部分细胞的遗传物质发生改变，并且具有癌变的特点，能无限地传代下去。③细胞株和细胞系的区别：细胞株的遗传物质未改变，存在接触抑制。一般传至10代后就不易传。细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，无限增殖。3、动物细胞培养的基本概念（1）细胞株与细胞系（2）原代培养与传代培养3、动物细胞培养的基本概念①、原代培养：将动物组织消化后的初次培养称为原代培养。②传代培养：贴满瓶壁的细胞重新用胰蛋白酶等处理，然后分瓶继续培养，让细胞继续增殖，称为传代培养。（3）接触抑制3、动物细胞培养的基本概念细胞在贴壁生长过程中，随着细胞分裂，数量不断增加，最后形成一个单层，此时细胞间相互接触，细胞停止分裂增殖，数量不再增加。细胞悬液10代细胞50代细胞无限传代原代培养传代培养细胞株细胞系细胞固定在瓶壁上生长和分裂。随细胞增多，细胞就会停止分裂增殖遗传物质改变传至10代后不易传下去贴壁生长细胞分裂生长到相互接触时就停止分裂增殖的现象叫接触抑制。(1)、无菌、无毒的环境（添加一定量的抗生素，定期更换培养液）(2)、营养（葡萄糖、氨基酸、无机盐、微量元素、维生素动物血清等。）(3)、温度和PH温度：36.5+（-）0.5℃,PH：7.2－7.4(4)、气体环境：O2和CO2（95%空气和5%CO2）4、动物细胞培养的条件离体培养的细胞对微生物和有毒物质没有防御能力补充培养基中缺乏的物质多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中，根据你所学的内环境的知识，思考以下问题：1.体外培养细胞时需要提供哪些物质？2.体外培养的细胞需要什么样的环境条件？P46讨论充足营养（糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等合成成分及血清等天然成分。）适宜温度、PH和气体环境；无菌无毒环境5、动物细胞培养技术的应用（1）生产蛋白质生物制品：病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体等。（2）获得大量自身的皮肤细胞，用于皮肤移植。（3）用于检测有毒物质。（4）用于生理、病理、药理等方面的研究，为治疗和预防疾病提供理论依据。获得细胞或细胞产物细胞的全能性细胞株、细胞系植物体培养结果快速繁殖、培育无病毒植株等培养目的葡萄糖、动物血清蔗糖、植物激素培养基特有成分液体培养基固体培养基培养基性质细胞增殖原理动物细胞培养植物组织培养比较项目6、植物细胞和动物细胞培养的比较动物细胞特点：分化潜能变窄：随着细胞分化程度的提高而逐渐受到限制，分化潜能变窄，这是指整体细胞而言。细胞核仍具有全能性：细胞核，它含有保持物种遗传性所需的全套基因，而且并没有因细胞分化而丢失基因，因此高度分化细胞的细胞核仍具有全能性。比较植物组织培养和动物细胞培养（原理、培养结果）？二、动物体细胞核移植技术和克隆动物将动物的一个细胞的细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成为一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育为动物个体。（克隆动物）分类胚胎细胞核移植：体细胞核移植：细胞分化程度低，恢复全能性容易细胞分化程度高，恢复全能性不容易1、动物细胞核移植概念卵黄膜1.核移植的受体细胞是什么？处在什么时期？2.通过什么手段激活受体细胞，构建重组胚胎？MⅡ中期卵母细胞诱导方法：物理或化学方法激活受体细胞，完成细胞分裂和发育进程。3.原理：4.为什么选择卵母细胞作为核移植的受体细胞？细胞核的全能性卵母细胞体积大、易操作，含有促使细胞核表达全能性的物质和营养条件。2、动物细胞核移植的过程请同学阅读P48图2-21思考下列问题体细胞培养取出核甲牛乙牛MⅡ中期卵母细胞去除核去核卵母细胞重组卵细胞核植入卵裂早期胚胎代孕母牛丙移植体细胞群克隆牛细胞核移植胚胎移植物理或化学方法激活2、体细胞核移植的过程供体细胞（供核）细胞培养体细胞卵巢卵母细胞（MⅡ中期：供质）去核无核卵母细胞注入重组细胞构建重组胚胎胚胎移植代孕母体生出与供体奶牛遗传基础相同的犊牛归纳:a.共分成两大阶段：核移植和胚胎移植b.取卵母细胞作受体细胞的原因是:卵母细胞体积大、易操作，含有促使细胞核表达全能性的物质和营养条件。c.严格来说新个体有母细胞的细胞质,所以严格上说还有些母本的性状。P49为使核移植的胚胎或动物的遗传物质全部来自有重要利用价值的动物提供的体细胞，在供体细胞的细胞核移至受体细胞之前，必须将受体细胞的遗传物质去掉或将其破坏。1.在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？2.用于核移植的供体细胞一般都选用传代10代以内的细胞，想一想，这是为什么？培养的动物细胞一般当传代至10～50代左右时，部分细胞核型可能会发生变化，其细胞遗传物质可能会发生突变，而10代以内的细胞一般能保持正常的二倍体核型。因此，在体细胞核移植中，为了保证供体细胞正常的遗传基础，通常采用传代10代以内的细胞。讨论3、体细胞核移植技术的应用前景（1）、在畜牧业中可以加速家畜遗传改良的进程。（2）、保护濒危物种。（3）、医药卫生领域生产医用蛋白质及组织器官的移植。（作为供体）（4）、了解胚胎发育和衰老过程；追踪研究疾病的发展过程和治疗疾病。4、体细胞核移植技术存在的问题（3）、克隆动物食品的安全性问题（1）、成功率非常低（2）、克隆个体的健康问题本节知识结构动物细胞培养和核移植技术动物细胞培养动物体细胞核移植技术和克隆动物核移植技术和克隆动物的概念体细胞核移植技术的过程体细胞核移植技术的应用前景体细胞核移植技术存在的问题细胞培养的概念细胞培养的过程细胞培养的条件细胞培养技术的应用1.幼龄与老龄动物的组织细胞比较，分化程度低的与分化程度高的组织细胞比较，哪一种更易于培养？思考一下，这是什么道理？细胞的衰老与动物机体的衰老有着密切的关系，细胞的增殖能力与供体的年龄有关，幼龄动物细胞增殖能力强，有丝分裂旺盛，老龄动物则相反。所以，一般来说幼年动物的组织细胞比老年动物的组织细胞易于培养。同样，组织细胞的分化程度越低，则增殖能力越强，所以更容易培养。1、在动物细胞培养过程中遗传物质发生改变的细胞是A．细胞系B．细胞株C．原代细胞D．传代细胞2.关于动物细胞培养的错误叙述是A.用于培养的细胞大都取自胚胎或幼龄动物的器官或组织B.将所取的组织先用胰蛋白酶等进行处理使其分散成单个细胞C.在培养瓶中要定期用胰蛋白酶使细胞从瓶壁上脱离，制成悬浮液D.动物细胞培养只能传50代左右，所培育的细胞会衰老死亡3、用动、植物的体细胞进行离体培养，下列叙述正确的是A.都要用到CO2培养箱B.都须用液体培养基C.都要在无菌条件下进行D.都可体现细胞的全能性4.（2007年海南高考）某研究小组进行药物试验时，以动物肝细胞为材料，测定药物对体外培养细胞的毒性。供培养的细胞有甲、乙两种，甲细胞为肝肿瘤细胞，乙细胞为正常肝细胞。请回答下列有关动物细胞培养的问题：（1）将数量相等的甲细胞和乙细胞分别置于培养瓶中培养，培养液及其它培养条件均相同。一段时间后，观察到甲细胞数量比乙细胞的数量。（2）在动物细胞培养时，通常在合成培养基中加入适量血清，其原因是。细胞培养应在含5%CO2的恒温培养箱中进行，CO2的作用是。多血清可以补充合成培养基中缺乏的物质维持培养液pH（3）在两种细胞生长过程中，当乙细胞铺满瓶壁时，其生长。药物试验需要大量细胞，两种细胞频繁传代，甲细胞比乙细胞可以传代的次数更。若用动物的肝脏组织块制备肝细胞悬液，需用消化处理。（4）为了防止细胞培养过程中细菌的污染，可向培养液中加入适量的。（5）已知癌基因X过量表达与肝肿瘤的发生密切相关，要试验一种抗肿瘤药物Y对甲细胞生长的影响，可将甲细胞分为A、B两组，A组细胞培养液中加入，B组细胞培养液中加入无菌生理盐水，经培养后，从A、B两组收集等量细胞，通过分别检测X基因在A、B两组细胞中的或者合成水平的差异，确定Y的药效。4.（2007年海南高考）某研究小组进行药物试验时，以动物肝细胞为材料，测定药物对体外培养细胞的毒性。供培养的细胞有甲、乙两种，甲细胞为肝肿瘤细胞，乙细胞为正常肝细胞。请回答下列有关动物细胞培养的问题：停止多胰蛋白酶抗生素药物YmRNA蛋白质课件制作仙游第一中学黄美洪3.你认为用上述体细胞核移植方法生产的克隆动物，是对体细胞供体动物进行了100%的复制吗？为什么？绝大部分DNA来自于供体细胞核，但其核外还有少量的DNA，即线粒体中的DNA是来自于受体卵母细胞。此外，即便动物的遗传基础完全相同，但动物的一些行为、习性的形成与所处环境有很大关系，核供体动物生活的环境与克隆动物所生活的环境不会完全相同，其形成的行为、习性也不可能和核供体动物完全相同，从这一角度看，克隆动物不会是核供体动物100%的复制。P49讨论1.进行动物细胞传代培养时用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是什么成分？用胃蛋白酶行吗？P44旁栏用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是蛋白质。胃蛋白酶作用的适宜pH约为2，当pH大于6时，胃蛋白酶就会失去活性。胰蛋白酶作用的适宜环境pH为7.2～8.4。多数动物细胞培养的适宜pH为7.2～7.4，胃蛋白酶在此环境中没有活性，而胰蛋白酶在此环境中活性较高，因此胰蛋白酶适宜用于细胞培养时的消化。P46旁栏2.为什么对动物细胞进行培养时通常要添加血清？血清中含有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等，其中蛋白质主要为白蛋白和球蛋白；氨基酸有多种，是细胞合成蛋白质的基本成分，其中有些氨基酸动物细胞不能合成（称为必需氨基酸），必须由培养液提供；血清激素有胰岛素、生长激素等及多种生长因子，促进细胞的生长、增殖和贴附。因此，细胞培养时，要保证细胞能顺利生长和繁殖，一般要添加10%----20%的血清。2.动物细胞培养要经过脱分化的过程吗？为什么？动物细胞培养不需经过脱分化过程。因高度分化的动物细胞发育潜能变窄，失去了发育成完整个体的能力，所以，动物细胞也就没有类似植物组织或细胞培养时的脱分化过程了。要想使培养的动物细胞定向分化，通常采用定向诱导动物干细胞，使其分化成所需要的组织或器官。3.1997年，美国威斯康星州的一个奶牛场有一头名叫卢辛达（Lucinda）的奶牛，年产奶量为30.8t，创造了世界奶牛产奶量最高新纪录。目前世界各国高产奶牛场奶牛，年平均产奶量一般为十几吨，而我国奶牛产奶量年平均水平仅为3～4t。（1）能利用体细胞核移植技术克隆高