细胞凋亡及其调控

第四章细胞凋亡及其调控细胞凋亡的特征及意义细胞凋亡的发生机制检测凋亡的常用方法和技术细胞凋亡的调控细胞凋亡与疾病Biochemistry&MolecularBiologyCell细胞凋亡（aopotosis，aGreekwordthatmeans“droppingoff”or“fallingoff”)是机体细胞在正常生理或病理状态下发生的一种自发的、程序化的死亡过程，其发生受到机体的严密调控细胞凋亡对多细胞生物的生长发育和正常生命活动至关重要，与许多疾病的发生也相关2002年10月7日英国人悉尼·布雷诺尔、美国人罗伯特·霍维茨和英国人约翰·苏尔斯顿，因在器官发育的遗传调控和细胞程序性死亡方面的研究获诺贝尔诺贝尔生理与医学奖。2002年诺贝尔生理与医学奖获得者（图片来自）§4.1细胞凋亡的特征及意义一、细胞凋亡的基本特征1、形态学特点单个凋亡细胞与周围细胞分离以胞浆空泡开始，与细胞膜融合，导致膜发泡。随后空泡自细胞内排出，引起水分丧失、细胞容积减少、细胞固缩染色质浓缩或重新分布于核膜下呈圆形或半月形最后细胞器也超浓缩，细胞核解体，细胞膜下陷，包裹着核碎片和细胞器形成凋亡小体凋亡小体最终被周围细胞吞噬Cellstructurechangesduringapoptosis.Thetoppanelshowsanormalcell.Thelowerpanelshowsanapoptosingcell;arrowsindicatecondensednuclearfragments.检测凋亡的常用形态学方法在实际研究中，为了对细胞凋亡进行严格、合理的评价，往往采用多种方法，联合应用。细胞形态学的评价(1)普通光镜、荧光显微镜观察分别对细胞核、质染色，计算凋亡细胞数目缺点：常受主观因素干扰，重复性较差ab(2)电子显微镜观察凋亡细胞膜表面变化，如膜发泡和某些结构的丢失，染色质固缩和线粒体超浓缩necrosisapoptosis凋亡细胞的生物化学特点（1）非随机性DNA降解：细胞凋亡过程中，核酸内切酶活化，基因组DNA被降解产生寡核小体片段，大小相当于核小体（180~200bp）的倍数（2）细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻：正常细胞的膜磷脂分布不对称，氨基类磷脂如磷脂酰丝氨酸和磷脂酰乙醇胺多分布在膜内侧。（3）正常的能量代谢（4）胞浆蛋白交联：凋亡细胞的mRNA和蛋白合成减少，诱导组织谷氨酰胺酶表达，在胞膜下形成壳状结构，使凋亡小体稳定3、凋亡细胞的结局在细胞凋亡末期，破碎的核片段由一层包被，形成凋亡小体，被邻近细胞，主要是巨噬细胞清除，不会导致周围组织损伤和炎症反应。坏死（necrosis）因溶酶体水解酶的释放而导致邻近组织的损伤和炎症反应NECROSISAPOPTOSIS二、细胞凋亡的生物学意义1、个体的生长发育(1)胚胎发育中特定种类细胞在完成其使命后通过凋亡而淘汰，代之以新的细胞类型指、趾、关节腔的形成，人、蝌蚪尾巴的消失(2)成年个体中，通过细胞凋亡清除衰老细胞并代之以新生的细胞，从而维持特定组织器官的细胞类型和数量的稳定皮肤和粘膜等细胞的更新（1.维持细胞总数和机体生活力2.调节细胞数量和质量3.参与形态建成）细胞凋亡在鸭和鸡的脚的形态发生中的作用细胞凋亡在非洲爪蟾发育过程中尾巴消失中的作用溶酶体中cathe-pasin酶的浓度2、淋巴细胞的成熟和维持免疫系统的功能在淋巴细胞的发育分化中，自身反应性B细胞克隆的清除一些免疫活性细胞可以通过诱导凋亡来杀伤靶细胞防止过高的免疫应答（受抗原刺激活化的T淋巴细胞自身可以通过激活诱导的细胞死亡过程而凋亡3、细胞凋亡与DNA和组织损伤、修复有密切联系细胞损伤严重，无法修复时，细胞通过凋亡清除；组织损伤后由肉芽组织转变为瘢痕过程4、细胞凋亡与衰老密切相关随着年龄的增长，许多类型细胞失去凋亡能力，可能是导致衰老和器官功能普遍下降的原因胸腺和淋巴细胞可能也丧失触发凋亡信号途径的能力5、细胞凋亡可能与多种疾病的发生有直接联系肿瘤，神经退行性疾病§4.2MechanismsofapoptosisApoptosisistriggeredbyavarietyofpathwaysOverviewoftheevolutionarilyconservedapoptotispathwayinC.elegansandvertebrates.Regulators促进或抑制凋亡，CED-9和Bcl-2在营养因子存在的情况下抑制细胞凋亡.Adapters作用于调控蛋白和效应蛋白;在营养因子存在的情况下促进效应蛋白的激活.蛋白酶caspases（胱天蛋白酶）是胞内一种重要的效应蛋白;其活化可导致胞内底物的降解，最终导致细胞死亡.一、caspase与细胞凋亡1、caspase的种类与性质胱天蛋白酶caspase（天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶）,活性位点含有QACXG（X=R，Q，C）保守氨基酸序列。这类酶都以无活性的酶原形式合成并存储在细胞中。N-端为一个序列、长度特异的原结构域，是caspase的活性调节结构域，其后是一个大亚基和一个小亚基序列。Caspase被活化时，在原结构域C-端及大、小亚基间保守序列的Asp位点被切割，游离的大、小亚基结合成异二聚体，其活性中心由两个亚基的部分氨基酸序列共同构成。caspase异二聚体可进一步二聚化，形成活性更强的四聚体。Caspaseactivationrequiresdimerizationandtwocleavages.迄今共发现14种caspase，根据其结构的同源性分3个亚家族：Caspase-1亚家族：caspase-1，4，5，11，12，13，14。它们的活化与炎症因子的合成有关，多数情况下不是细胞凋亡的直接效应分子。Caspase-2亚家族：caspase-2Caspase-3亚家族：caspase-3，6，7，8，9，10。它们都直接参与介导细胞凋亡过程根据caspase前体分子(procaspase)的N-端原结构域,以及它们在细胞凋亡中的作用不同，caspase-3亚家族也可以分两类：①具有”long-prodomain”的起始分子initiators，如caspase-8,9,10等。可以通过这种long-prodomain与胞膜上的受体和接头蛋白构成的caspase激活复合物结合，结果使caspase起始分子发生聚集，并通过分子间切割而活化，继而切割活化下游的caspase分子。②具有“short-prodomain”的效应分子，如caspase-3,6,7。它们不能相互聚集，只能作为上游caspase的底物，活化后作用于胞内多种蛋白质或酶类，促使细胞凋亡。(p517,表21-2）caspase对底物的酶切作用是高度特异的，至少可识别包括Asp在内的4个氨基酸残基并切割Asp后的肽键，该作用同时受底物空间结构的影响。不同的caspase对其底物的氨基酸序列亲和力不同，与其功能相适应。N--Asp–X–X-X--C疏水多样化可变，Glu最佳FourcaspasepathwaysinvolvedinapoptosisAdaptedfrom“CytokineBulletin”Celltype-specificeffectorofapoptosis-inducingagentsoncaspase-9orcaspase-3deficientmice2、caspase的活化在不同的细胞凋亡因素刺激下，caspase在细胞内可以通过多种不同的途径被活化，然后切割并激活下游的caspase分子，介导细胞凋亡。（1）由死亡受体介导的“诱导接近”模型：如caspase-8，在上游分子的作用下寡聚化，然后紧密结合的caspase-8分子之间可以发生切割，释放p18和p10至胞浆，并装配成活性蛋白酶。这种起始活性蛋白酶将进一步激活下游的效应蛋白酶caspase-3,-6,-7，或另一分子起始蛋白酶caspase-9。（2）caspase-9的活化通常需要线粒体的参与。Caspase-9在线粒体释放的细胞色素C和dATP存在下，通过与Apaf-1的CARD(caspaserecruitmentdomain)结合成一个复合体而得以活化，然后再去激活下游分子，包括caspase-3以及可能随后被激活的caspase-2,-6,-8,-10,诱导细胞凋亡。Cytc和dATP与Apaf-1结合并诱导后者构象变化，更易聚集caspase-9效应caspase,如caspase-3,-6,-7,主要通过上游caspase的切割而活化。切割后游离的大、小亚基装配成活化caspase。caspase活化后的功能?3、活化的效应caspase诱导凋亡的机制细胞内有上百种caspase的底物蛋白，如聚（ADP-核糖）多聚酶（PARP）；DNA依赖的蛋白激酶；IkB-α；蛋白激酶C、δ和θ；Rb蛋白；Ras-GTPase活化蛋白；MEKK1；Akt-1和Fak等对于其中一些底物的认识提示，caspase可能通过以下几种机制参与凋亡（1）灭活细胞凋亡抑制蛋白如caspase对ICAD/DFF45的剪切CAD(caspase活化的DNA酶）是一种导致细胞发生随机性DNA降解的特定核酸酶。非凋亡期，CAD和ICAD（inhobitorofCAD）结合形成无活性复合物细胞凋亡时，caspase剪切ICAD使其失活，CAD从而游离并进入细胞核，降解DNA。DFF：HeLa细胞中分离的DNA片段化因子，ICAD同源分子（2）剪切细胞结构蛋白如caspase对核板的降解作用核板是衬托于核内膜表面的坚固结构，与染色质的组织密切相关。它由核纤层蛋白的头尾多聚体组成。细胞凋亡过程中，caspase在单一位点剪切核纤层蛋白，导致核板塌陷和染色质浓缩。Caspase剪切的还有肌动蛋白，Fak和核分裂相关蛋白等。（3）剪切核效应蛋白Caspase可能作用于DNA修复、mRNA拼接和DNA修复相关蛋白，使其活性丧失或失调。聚（ADP-核糖）多聚酶（PARP）与DNA修复、基因完整性监护有关；细胞凋亡启动时，PARP被剪切，导致其氨基端的两个结合DNA的锌指结构与羧基端的催化结构域分离，进而丧失其正常功能。4、caspase活化的抑制剂细胞内存在一些caspase的抑制蛋白，防止caspase的非特异性活化。一些病毒蛋白或人工小肽也可以抑制caspase（1）IAP(inhibotorsofproteins)家族可以通过与死亡受体复合物上的TRAF结合而阻止细胞凋亡（2）一些caspase的底物如IL-1β以及一些人工小肽，是caspase的抑制剂（3）一些能阻断long-prodomain相互作用的物质如sentrin能特异性结合Fas，却不能结合FADD，从而阻断了caspase-8的活化（4）丝氨酸蛋白酶抑制剂如昆虫病毒蛋白p35,牛痘病毒蛋白CrmA等，都能抑制caspase的活性（5）FLIPs家族在病毒中发现的凋亡抑制剂，结构域中含有DED，与FADD或caspase-8竞争结合而发挥负调节作用5、介导细胞凋亡的其它酶类核酸内切酶:多数作为caspase的底物而被活化并发挥作用，在核小体连接处切割染色体蛋白激酶：一些与caspase相互作用影响细胞凋亡的蛋白激酶，如PKC，DNA-PKcs（DNA-依赖性蛋白激酶，一种哺乳动物丝/苏氨酸蛋白激酶，参与损伤DNA的修复、维持细胞结构与功能的完整性，可被caspase-3催化而灭活）总之，caspase是细胞凋亡调控的关键分子群，其活化是不同凋亡途径中共同的下游事件。活化的caspase通过切断与周围细胞的联络、重组细胞估价、阻止DNA复制和修复、破坏DNA和核结构、诱导凋亡小体的形成等，在细胞凋亡中起重要作用。KeyConcepts靶细胞表面的Fas受体与作用细胞质膜表面的FasL