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激光共聚焦使用步骤总结共聚焦实验步骤1.提前将PBS放在37度水浴锅中。2.将小皿从细胞培养箱中取出，弃掉培养液，用PBS洗2——3次，轻晃几下即可。注，此步加PBS时一定要轻一点，否则细胞会漂浮起来。3.弃掉PBS后加1ml4%多聚甲醛，固定细胞，室温静置30min。4.弃掉后加PBS，1ml，3次，5min/次，可在摇床上轻晃。5.弃掉后加0.1%Triton-X1001ml，室温透膜静置15min。6.弃掉后加PBS，1ml，3次，5min/次，可在摇床上轻晃。7.5%PBS脱脂乳，封闭1h，可在摇床上轻晃，也可以室温静置。8.一抗1h，可在摇床上轻晃。9.PBS，1ml，3次，5min/次，可在摇床上轻晃10.二抗1h。避光可在摇床上轻晃11.PBS，1ml，3次，5min/次避光，可在摇床上轻晃12.DAPI染色15min避光，室温静置13.PBS，1ml，3次，5min/次，避光，可在摇床上轻晃14.激光共聚焦显微镜观察。激光共聚焦显微镜使用步骤1.打开五个绿色按钮和一个钥匙2.将物镜调至最低点。3.电脑开启，选择TCS_User4.双击LASAF注意，双击软件后就耐心等待不要碰显微镜上任何东西，此时系统正在校准数据。5.点击OK6.选择configuration7.点击像“注射器”一样的图案Laser，此时后便会出现一个画面，四个小格405Diode，Ardon，HeNe543，HeNe633和一个尺子一样的长线Standby。8.点击选择前三个小格405Diode，Ardon，HeNe543，将Standby拉到45左右。9.选择Acquire10.先确定右侧区域油镜型号是Objective：63×1.4，如果不是点击下拉菜单选择。11.选择seq，最下面会弹出SequentialScan区域，该区域作用是根据自己实验需求选择相应激光通道，其中“＋”代表增加激光通道，“－”代表删除激光通道。12.选择需要的通道数，而后点击下方的betweenframes13.而后开始确认每个数字到表的激光种类，点击一个数字，而后去右上区域的leicasettings点击下拉菜单选择，选好后再点击旁边的“UV”下拉菜单选择代表最大的“…..”。例如，第1道我想确定为FITC激光，首先要先点击“1”，然后无右上部的“leicasettings”选择FITC,而后将“UV”选择“…..”，以此类推。至此，软件部分准备已结束。14.将实验台上棕色瓶子的油镜专用油抹到物镜上，将样品放在载物台上，固定好。15.显微镜左侧有很多按钮，其中最下面的TL/IL是用于打开自然光的。按一下这个按钮就可以在镜下看到亮光，调整螺旋，直到镜下看到细胞为止。小窍门儿：显微镜右侧也有按钮，其中有两个上下箭头的是调整物镜高度的，看的时候可先按向上的箭头，调至最高后再稍微调整一下螺旋就可以在镜下看到细胞。16.显微镜正对着使用者的区域也有好多按钮，其中SHUTTER是控制激光通过的按钮，右侧中间的大写字母A在一个小方框中的按钮是看蓝光，最左侧的小方格中写着13是看绿光中间的N2.1是看红光。根据自己需要可镜下肉眼观察。17.而后转到电脑旁，选择软件上SequentialScan相应的通道数字，点击下方的LIVE。此时在第二个电脑屏幕会出现扫描画面。18.在键盘和电脑屏幕之间会有五个螺旋钮，第一个螺旋钮是调整电阻的，电阻越大画面越清晰，同时背景也会增加。第二个螺旋钮则是降低背景的。第三第四螺旋钮一般不用。第五个螺旋钮是降低噪点的，一般也不需要使用。19.此时如果想选择某个或某几个细胞，可以点击左侧栏里有一个ZoomIn的小方格，点击后会出现一个红色的勾，然后拖动鼠标去画面上直接选择想要的区域即可。20.调整螺旋钮将画面调整到自己最满意的亮度后，点击STOP.(原来的LIVE点击后变为STOP)21.下一步是成像。22.照相的时候在ZoomIn的上方有Format和Speed两个区域，在Format选择下拉菜单将系统自定的“512×512”改为“1024×1024”，将Speed的“400Hz”改为“200Hz”。同时将ZoomIn下方的LineAverage将“1”改为“3”.23.点击屏幕最右下角，有一个Start，而后在右侧屏幕即会出现所照的照片。在照片屏幕右上角区域，有一个或几个标着数字的小格，每个代表的是不同激光通道的照片，在数字下方有一个小格像是几张纸叠起来的小格，代表的是合成图片，点击一下合成物片便会显现。24.在照片屏幕左下方有一个柱状的有颜色的图案，上下各有两个可滑动的键，上面的键可用于增加亮度，下面的键可用于降低背景。25.将所有照片照好后，点击Experiments，找到储存照片的文件夹，查看每张照片，最最后的修改。然后输出图片。26.输出图片的方法。右击Experiments中相应的文件夹，选择最下方的Export，选下拉菜单AsTiff。弹出ExporttoTIFF对话框，点击Browse选择需要储存到我的电脑D盘users里面自己的文件夹，然后选择上下两个区域的第一个小黑格子（分别是overlaychannels和timestamp），点击确定。再重复上述操作，将上边区域的小黑格子去掉，至保留下面区域的小黑格子，在保存一次。保存两次的目的是不近将单个图片输出，同时也将合成图片输出。打开自己的文件夹，查看文件是否全部输出，确认后将软件关闭即可。27.图片拷贝28.因为激光共聚焦仪器比较昂贵，所以所有文件要求要用光盘拷贝。29.双击桌面上的NeroStartSm…30.打开后，在软件上方选择相应的光盘类型，CD/DVD,CD,DVD。31.而后点击MakeDataCD，弹出新的对话框。32.选择对话框右侧的Add，选择相应的文件夹添加上，而后添加画面还会弹出，选择close即可。33.然后点击软件右下角的NEXT34.弹出NeroExpressEssentials对话框35.在Currentrecorder选择最下面的自己的光盘类型。36.如果是可重复拷贝的光盘，则要在最下方的区域点击Allowfilestobeaddedlater（multisessiondisc）37.最后点击最右下角的Burn。此时便开始拷贝数据了。数据拷贝结束后，光盘会自行弹出。关闭电脑将五个绿色按钮和钥匙全部关闭即可，另外不要忘记将物镜调至最低点。