血管形成在肿瘤临床中的意义

血管形成在肿瘤临床中的意义实体肿瘤的生长及存活依赖血管形成，已为广大的肿瘤学家们所公认。新生血管通过灌注形式为肿瘤细胞生长提供营养供给，也是肿瘤细胞代谢产物排泄的有效途径，同时新生的血管也是肿瘤向远处转移的重要途径；而在没有血管形成的情况下，肿瘤的营养供给及代谢物排泄仅能靠简单的物理弥散，这就严重地限制了肿瘤细胞的生长及其向远处扩散的可能性。临床的研究证明肿瘤血管形成与肿瘤病人的预后有密切的相关性，临床前的研究证明抗血管形成治疗可以有效地控制肿瘤的生长，因此，肿瘤新生血管被认为是一个有价值的治疗靶点，抗肿瘤新生血管研究也是肿瘤学中的一个研究热点。肿瘤生长依赖血管形成的依据1971年，Folkman博士在《新英格兰医学杂志》上首先提出了肿瘤生长依赖血管形成的观点（Tumorgrowthisangiogenesisdependent）。人们经过大量的研究进一步证实了新生血管形成与肿瘤发生、发展的关系，并且研究发现了许多抗新生血管形成的技术及制剂，这些制剂及方法在体外及体内实验中取得了喜人的成果。早在1945年，人们在研究创伤及肿瘤对血管的影响时，就发现了一个有趣的现象，将肿瘤细胞置于一个有半透膜的小室内，然后将此小室埋在小鼠的皮下，结果发现小室内的肿瘤细胞在新生血管形成前生长缓慢，而当小室内有新生血管形成后，肿瘤细胞生长迅速加快；同时也发现在小室的半透膜面，新生血管形成丰富，提示新生血管形成对肿瘤生长有利；而肿瘤细胞本身也有诱导新生血管形成的作用。早期的研究还发现，移植于离体的灌注脏器内肿瘤，因在灌注脏器是没有血管形成的，所以肿瘤在离体灌注的脏器内生长缓慢，肿瘤保持在1-2mm3大小；当将离体脏器再移植回宿主体内后，新生血管形成明显，肿瘤则迅速长大至1-2cm3，并且将宿主动物致死。动物实验发现，将肿瘤细胞团混悬于眼前房中，因前房中无血管形成，所以肿瘤体积始终保持在1mm3左右，可以维持很长一段时间，但肿瘤仍然保持存活；然而，一旦将这些肿瘤移植到虹膜后，新生血管迅速形成，肿瘤生长迅速，在2周内可从增加至原大小的1600倍。鸡胚尿囊膜模型研究证明，在无血管期肿瘤生长通常受到明显的限制，肿瘤的直径多在0.93±0.29mm，当进入血管期后，肿瘤在血管形成的24小时内迅速增长，通常在7天左右长达直径8.0±2.5mm。尿囊膜通常发生在鸡胚发育的第5天，其血管内皮细胞3H-TdR的掺入值，随着时间的推移逐步降低，在第八天时急速下降。按时间顺序连续在尿囊膜上移植肿瘤发现，随着时间推移，血管内皮细胞的生长速率在下降，血管形成在减少，甚至血管萎缩，肿瘤的生长亦与之相应的降低。1989年Folkman等在《自然》杂志上发表了一个转基因小鼠的实验结果，在鼠胰腺β细胞中转入SV40Toncoprotein基因后，β-细胞在4-6周时，即出现增生现象，39.5周时约50%的胰岛出现增生的β细胞；但仅有一小部发生癌变。通过体内外的研究发现，能引起新生血管形成的增生细胞与肿瘤的发生之间有着密切的关系；而良性增生往往不伴有诱生新生血管的能力。提示血管形成在肿瘤的发生过程中有重要的作用。以上的研究都证明，肿瘤与血管形成之间有着密切的关系，虽然未能直接地证明肿瘤的生长是依赖血管形成的，但是间接地提示了这一现象中的一种必然联系的存在。然而，随着研究的不断深入，尤其是从80年代末开始，人们找到许多肿瘤的生长依赖血管的直接证据。1993年Kim等发表的一个裸鼠体内的研究结果证明，有三株人肿瘤细胞生长是依赖于血管内皮细胞生长因子（VEGF）对新生血管形成的促进作用，应用抗VEGF的抗体阻断VEGF的效应后，肿瘤的生长即受到明显的抑制。Gross及Hori等分别报告，腹腔内注射碱性纤维母细胞生长因子（bFGF）后可以刺激原发肿瘤的生长及转移；而使用抗bFGF的特异性抗体后，可以抑制70%依赖bFGF刺激的血管形成而生长的肿瘤。烟曲霉素的衍生物TNP-470是一个作用明确的血管形成抑制剂，对血管内皮细胞有特异性的抑制作用，动物体内的研究发现，它可以明显抑制原发肿瘤及转移灶的发生。TNP-470抑制肿瘤呈剂量依赖性。使用TNP-470后，B16BL6黑色素瘤、M5076视网膜细胞肉瘤、Lewis肺癌及walker256肿瘤的大小分别减少到对照相的16％、10％、17％及4％。同时，TNP-470还抑制可以M5076肉瘤的肝转移。Millauer等使用逆转录病毒将突变的位点缺陷VEGF受体FLK－1转导至脑胶质瘤中，结果肿瘤的血管形成受到抑制，肿瘤生长亦受到明显抑制。血管形成的临床意义以上的研究从直接及间接的方面都证明了血管形成在肿瘤的发生及转移中起着重要的作用。在临床上新生血管形成同样具有重要的意义，肿瘤血管形成与肿瘤转移及预后密切相关。1992年，Macchiarini报道了肺癌中血管形成研究的结果，作者计数手术切除的87例T1N0M0的NSCLC患者的癌组织平均血管密度及数量，发现微血管密度和转移的发生明显相关。在放大200倍的显微镜下，微血管数为0～9/HP显相关。在放大200倍的显微镜下，微血管数为0～9/HP时，肿瘤转移发生率为9.2％；10～19/HP时，为62％；20～30/HP时为100％。如果以0～9/HP者发生转移的相对危险度为1，那么，10～19/HP者则为2.42；20～30/HP者则为20。Giampietro研究了乳腺癌患者肿瘤组织中血管密度与预后的关系，发现乳腺癌患者的死亡率及复发率与微血管密度呈正比。血管密度超过100/HP者，有39％复发，其中20.7％的患者死亡；相反，微血管密度低于33/HP者仅4％复发及死亡。Saclarides研究大肠癌患者，血管密度与预后的关系发现，血管密度在病变已穿透粘膜及5年内死亡的患者中明显高（P＝0.002及P＝0.013）.血管形成的发生机制迄今人们对血管形成的机制仍不甚明了，血管形成是一个极复杂的病理生理过程，包括许多的环节。通常认为肿瘤血管形成的过程主要包括以下几个步骤：①血管内皮下基底膜溶解及内皮细胞活化；②内皮细胞向肿瘤组织迁移；③内皮细胞增殖，并形成细胞条索；④形成新生血管。在这一过程中包含了肿瘤细胞与正常内皮细胞间、与细胞外基质的相互作用、相关细胞的参与及大量细胞因子的调节，使得新生血管得以形成。在正常的情况下，血管形成是受到严格地调控的，而在肿瘤组织中这种平衡则完全倾向血管形成一方。胞可以产生大量的细胞因子刺激血管内皮细胞增殖、迁移及血管形成。其中活性较强的因子包括酸性及碱性纤维母细胞生长因子（aFGF及bFGF），血管内皮细胞生长因子（VEGF）及内皮细胞生长因子（EGF）等。在多种肿瘤组织中，VEGF往往大量存在于肿瘤坏死与活跃长生的细胞之间的区域，提VEGF可能是这些肿瘤血管生成中重要的介质。内皮细胞表面存在有大量的VEGF受体（VEGFR、flki/flt-1）许多因子是通过调节VEGFR的表达来调控血管的形成。抗血管形成在肿瘤治疗中的意义血管形成为肿瘤细胞生长提了条件，肿瘤细胞的生长需要有血管形成，而血管的增生亦为肿瘤转移提供了条件，肿瘤细胞可以通过不成熟的毛细血管进入血流形成远处转移。所以人们选择了血管形成作为一个肿瘤治疗的靶点。同时，血管形成作为靶点，还有一个有利的条件，在正常的成人中，除了创伤愈合及生殖周期外，几乎所有的新生血管形成都是病理性的，如肿瘤、风湿性关节炎及糖尿病眼底病变等。所以选择这一靶点也是更安全、毒副作用更小的治疗方法。如何阻断血管形成这一病理过程，从理论讲可以有以下几个方面：①抑制蛋白降解酶的活性，防止内皮细胞活化；②干扰血管生成因子的合成、释放及生物效应的发生；③阻止内皮细胞的增殖；④阻止内皮细胞的迁移。近十余年来，人们寻找抗血管形成药物方面作出了很大的努力，并且已使很多的临床医生看到了它们的前锦。在美国已有近百种的制剂在进行临床验证，有的已经到了Ⅲ期。在研究的药物中包括有化学合成的药物、有基因工程、蛋白质工程的产物，如内皮细胞的抑制因子、人源化的抗体等以及反义的核酸等。1994年，O'Reilly博士等在Folkman博士的实验室发现一种有趣的现象，荷Lewis肺癌的小鼠，一旦Lewis肺癌从移植部位切除后，在肺内会很快出现转移的现象，其肺内转移灶的数目，可以达到原发灶未切除鼠的10倍。他们推测Lewis肺癌细胞产生某种抑制肿瘤转移的物质。Folkman等使用重度联合免疫缺陷（SCID）鼠的模式，同样证实了这一结果，说明免疫功能在这一现象中不是重要的。后来发现荷Lewis肺癌小鼠的血清及经过透析与浓缩的小便均可以抑制小鼠体内转移癌的发生，并且发现他都可以明显抑制牛毛细血管内皮细胞的增殖。而正常小鼠的血清及尿液则无此作用。为了找到这一抑制血管形成活性的物，Folkman博士及其同事们终于从荷Lewis肺癌小鼠的血及尿液中分离出一种分子量为38kb的蛋白质，并证明了它抑制血管内皮细胞增殖的活性。通过对此蛋白质进行测序后发现，该蛋白质与人纤维蛋白酶原的片段有98％的同源性。他们为这一蛋白质命名为血管抑素（Angiostation）。为了证明人血纤维蛋白溶酶原来的血管抑素确有抑制肿瘤转移的作用，他们在小鼠的模型中使用了血管抑素，结果发现使用血管抑素组的1/18（P〈0.001）。进一步的研究，他们又发现了内皮抑素（endstatin），并证明血管抑素与内皮抑素联合使用将更加有效。虽这两种药品已由美国恩特利医药公司生产，但此药物都还未上临床。从基因水平看，癌基因的活化使细胞具备一些促血管形成的能力，如释放一些蛋白酶，化学趋化因子及促血管形成因子等，而抑癌基因则可以抑制肿瘤的转移能力，如P53，nm-23等。肿瘤内的新生血管是从原有的血管基础上“芽生”而来的，肿瘤细胞及由化学趋化因子招引来的巨噬细胞等释放蛋白降解酶，如金属基质蛋白酶家族（MatrixMetaloproteinases,MMPS），它们可以降解基质、基底膜等，使静止的内皮细胞被活化，同时，基质降解后，一些储于基质中的生长因子被释放出来，可进一步刺激内皮细胞增殖。促进血管形成的因素中，各类生长因子是一个重要的组成部分，肿瘤细胞可以产生一部分，更主要的是招引来的细5自然产生的血管生长抑制因子是体内调节血管形成的重要组成成份，PF4，IL-12等抑制血管内皮细胞增殖的因子已经开始进入Ⅱ期临床。还有一些拮抗刺激血管内皮增殖、移动及小管形成的生长因子的药物亦开始的临床应用研究，RhuMabVEGF已进入Ⅱ/Ⅲ期临床SU5416正开始进行Ⅰ期临床。TNP-470[AGM-1470,O-(chloroacetylcarbamoyl)fumagillol]是一种半合成的烟曲霉素（fumagillin）衍生物。从Aspergillusfumigatus发酵液中分离的烟曲霉素能够抑制体外内皮细胞的增殖和体内肿瘤诱导的血管生成，抑制肿瘤在小鼠体内的生长，但同时也引起小鼠体重的严重下降。在烟曲霉素碱水解产物烟曲霉醇（fumagillol）结构的基础上合成的TNP-470毒性较低，其抑制体外血管内皮细胞生长的能力比烟曲霉素要强50倍以上。TNP-470能抑制小鼠Lewis肺癌、B16黑色素瘤、M5076视网膜细胞肉瘤、MethA肉瘤、结肠癌以及EHS肉瘤等多种肿瘤的生长，对体外培养的人肿瘤细胞（如HL-60、鳞状细胞LS-180、HSC-1和结肠癌COLO205）也有显著的生长抑制作用。小鼠皮下注射TNP-470（30mg/kg）100天以上未观察到脱毛、内分泌紊乱、感染等明显副作用。TNP-470能显著抑制鸡胚尿囊膜和大鼠角膜血管生成，抑制大鼠海绵移植模型中bFGF诱导的血管生成；在大鼠血管器官培养中，能选择性抑制内皮细胞形成毛细血管状结构，但对非内皮细胞生长几乎不产生影响。动物实验证实，TNP-470对小鼠肾癌、人恶性胶质细胞瘤、雌激素诱导的大鼠唾腺瘤及兔VX-2癌的生长都有抑制作用，并能延长Walker256癌的荷瘤小鼠的存活期；TNP-470还能剂量依赖性地降低B16-BL6实验性转移的肺克隆数，延长荷