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1Speaker:xxxInstitution:xxxCancer-SpecificRetargetingofBAFComplexesbyaPrion-likeDomainMethod:EXPERIMENTALMODELANDSUBJECTDETAILS2CellsIntroductionFeatureMesenchymalStemCells(MSC)人间充质干细胞作为尤文氏瘤可能的起源进行研究A637人尤文氏瘤细胞系低表达EWS-FLI1SK-N-MC人尤文氏瘤细胞系高表达EWS-FLI1U2OS人骨肉瘤细胞系不表达EWS-FLI1SAOS2人骨肉瘤细胞系不表达EWS-FLI1HEK293-T人肾上皮细胞系包装慢病毒EXPERIMENTALMODELANDSUBJECTDETAILS3LentiviralGeneration41.构建包装质粒和转移质粒2.包装质粒和转移质粒共转染HEK293T细胞3.培养48-72小时，收集培养液，离心浓缩4.转染目标细胞5.检验敲除或过表达效率：mRNA水平：RT-qPCR蛋白质水平：WesternblotLentiviralGeneration5Genedeliveryvectorandpackagingvectorspspax2andpMD2.G:GenedeliveryvectorandpackagingvectorsGAG/POLandVSVplasmids:Method:PEI转染Method:LT1转染Real-TimeQuantitativeRT-PCR6WesternBlotAnalysis7NuclearExtractPreparation8由于本文中研究的EWSR1、FLI1、EWS-FLI1、BAF复合体等定位于细胞核，所以体外实验需要抽提核蛋白Immunoprecipitations、DepletionStudiesandMassSpectrometry9（1）收获细胞，加入适量细胞IP裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂）免疫沉淀，冰上或者4℃裂解30min,12,000g离心30min后取上清；（2）取少量裂解液以备Westernblot分析，剩余裂解液将1μg相应的抗体和10-50μlproteinA/G-beads加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜；（3）免疫沉淀反应后，在4°C以3,000g速度离心5min,将proteinA/G-beads离心至管底；将上清小心吸去，proteinA/G-beads用1ml裂解缓冲液洗3-4次；最后加入15μl的2×SDS加样缓冲液，沸水煮10分钟；（4）SDS-PAGE,Westernblotting或进行质谱分析。UreaDenaturationStudiesandDensitySedimentationAnalyses10UreaDenaturationStudiesDensitySedimentationAnalyses用于检验EWSR1和EWS-FLI1是否是BAF复合体的核心成分用于检验EWSR1和EWS-FLI1是否是BAF复合体的核心成分浓度范围：0.25to2.5Murea；使用尿素浓度梯度处理，比较EWSR1与BAF复合体相互作用减弱的尿素浓度ChIP-seq11（1）甲醛交联整个细胞系（组织），即将目标蛋白与染色质连结起来；（2）分离基因组DNA，并用超声波将其打断成一定长度的小片段；（3）添加与目标蛋白质特异的抗体，该抗体与目标蛋白形成免疫沉淀免疫结合复合体；（4）去交联，纯化DNA即得到染色质免疫沉淀的DNA样本，准备测序；（5）将准备好的样本进行深度测序。ChIP-seqBioinformaticAnalysis12RNA-Seq13(B)ATAC-seqanalysis14ChIP-seqvsATAC-seqPhaseTransitionPropertiesassess151.Biotinylatedisoxazole-MediatedPrecipitation2.Proteinpurificationandsedimentationassays3.Confocalimagingofimmunofluorescence可沉淀具有低复杂性结构域的蛋白质，如EWSR1。研究融合蛋白EWSR1Z-FLI1在有生物素化异恶唑时的沉淀情况大肠杆菌体外表达GST-EWSR1-FLI1及GST-FLI1，再研究各自的沉淀情况比较MSCs中V5-EWS-FLI1和V5-FLI1的点的形状G1arrestexperiments16使用帕布昔利布（Palbociclib），抑制A673细胞的CDK4/6激酶，使其停滞在G1期17Thanksforlistening!