基因转染技术

LOGO分子生物学技术在药理中的应用基因转染技术主要内容概述1基因运载系统转染的基本过程外源基因的表达和检测2345主要应用一、概述基因转染的定义：将具生物功能的核酸转移或运送到细胞内并使核酸在细胞内维持其生物功能。基因转染技术：将纯化的含有靶基因的质粒DNA送入细胞内，并在细胞内表达。基因转移技术已广泛用于基因的结构和功能分析、基因表达与调控、基因治疗与转基因动物等研究。基因转染方法转染通过生化或者物理方法将目的基因导入真核细胞中。方法分类感染通过病毒介导，用基因组中携带有克隆目的片断的病毒来感染靶细胞。二、基因运载系统将某一特定的靶基因传递到靶细胞，需要应用某一基因运载系统，目前将这一系统概括为两大类：非病毒方法和病毒方法（一）非病毒方法分类直接注射法磷酸钙共沉淀法脂质体染法显微注射法受体介导的基因转移电穿孔法微粒子轰击法DEAE-葡聚糖和polybrene聚阳离子法精子载体法为什么需要应用转染试剂或其他方法?DNA:带负电荷、亲水Noionicinteraction++++++++++Cationicmacromolecule++++++CationicReagentMembrane:anionicandhydrophobic----------HeparanSulfateProteoglycanes、1、直接注射法将含有DNA的溶液直接注射到肌肉，以引起邻近的细胞摄入DNA链进行表达，在肌细胞中，基因表达可持续数月。、2、磷酸钙共沉淀法将氯化钙、DNA和磷酸盐缓冲液混合，形成磷酸钙微沉淀，附着于细胞膜并经过细胞内吞作用进入细胞质。该方法的转化效率通常很低。影响因素：（1）DNA-磷酸钙共沉淀物中DNA的数量（2）共沉淀物与细胞接触的保温时间（3）甘油或DMSO等促进因子作用的持续时间等。一般说来，在磷酸钙转染实验中要使用高浓度的DNA(1～50ug/ml)。DNA磷酸钙共沉淀物同细胞接触的最适保温时间，因细胞的类型而异。促进因子通常是在DNA-磷酸钙共沉淀物被细胞吸收4～8小时之后再加入。、3、脂质体转染法脂质体能在体内或体外提供运载外源性遗传物质进入细胞的载体。制备程序比较简单，可以通过多聚碳酸脂滤膜(polycarbonatefilter)消毒灭菌，用它包装的DNA在4℃下可长期保存不失活性，以及毒性低、包装容量大、可保护DNA免受核酸酶的降解作用等等脂质体介导的基因转移的最大优势在于能在活体内应用。、图1.阳离子脂质体介导的转染、4、受体介导的基因转移依靠受体介导的细胞内吞途径以转移外源基因。受体介导的基因转移方法是在质粒DNA和某种特异的多肽（配体）之间形成复合体，而这种多肽能为细胞表面的受体所识别。如若将DNA在体内运送至肝内，可以选去唾液酸糖蛋白受体介导系统(肝.实质细胞)和甘露糖受体介导系统(肝.非实质细胞)、聚阳离子受体介导的转染过程、5、显微注射法在显微镜下，将DNA经同细胞玻璃针直接注入细胞，该法适合于各种培养生长的细胞，但需要一定的设备和操作技巧。、6、电穿孔法电穿孔通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中转导分子。即利用脉冲场将DNA导入培养细胞。电脉冲和场强的优化对于成功的转染很重要。在高压电场的作用下，细胞膜发生临时性破裂形成微孔微孔的关闭：一种天然衰减的过程，在0℃下，这种过程会被延缓进行。电穿孔之前若用秋水仙酞胺(colcemid)预处理细胞10小时，可提高转化效率3～10倍。电穿孔转染效率主要取决于所用的细胞类型。主要征对不适合用传统方法转染的细胞准备DNA:构建提质粒线性化准备细胞：0.5～1×107将细胞、DNA加入电极杯冰上预冷（！）设置电脉冲参数电击常温静置转移细胞至培养皿24－36小时后加筛选药物如：G418筛选，4－5天细胞开始死亡，2周后出现阳性细胞的克隆增殖，4－5周后可以挑克隆鉴定、7、微粒子轰击法（基因枪）在真空状态下，利用粒子加速器将外面包裹了外源基因DNA的金颗粒或钨粉微颗粒进行加速，打入完整的细胞中，从而使外源基因DNA得以在靶细胞中稳定转化并有可能获得表达。实验结果表明，用这种方法靶基因可在皮肤、肌肉、肝、胰、胃和乳腺等细胞中表达。美國Bio-Rad公司PDS-1000型/He基因槍、8、DEAE-葡聚糖和polybrene聚阳离子法二乙氨乙基葡聚糖(diethyl-aminoethyl-dextran)带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚体复合物和带负电的DNA分子使得DNA可以结合在细胞表面。通过使用DMSO或甘油获得的渗透休克将DNA复合体导入。DEAE－葡聚糖仅限于瞬时转染。、9、精子载体法用精子和NDA（吡啶核甘酸辅酶）-剂孵育，可捕获得DNA。通过受精过程，将外源性基因导入受精卵，大大简化了转基因动物的制备过程。这项转染方法是近年来才发展出来应用在鱼类转殖的最新技术，它最大有点就是简单方便。、病毒作为基因转移是基因递送良好的工具，病毒载体的优点有：（1）在转化的细胞中传播重组的DNA分子作为稳定的遗传成分；（2）可能将有缺陷的或突变的基因置于病毒调节信号的控制下以进行研究；（3）能将克隆的基因作为病毒微染色体的一部分，并能进行分离；（4）转移效率较高。其主要缺点是病毒载体对外源基因的最大容纳量只有2500bp。目前常用的病毒载体有下列几种。（二）基因转移的病毒的方法、1、逆转录病毒载体逆转录病毒为RNA病毒，它们的基因组编码在一条单链RNA上，病毒进入细胞通过逆转录作用，病毒RNA即转变为双链DNA分子，DNA进入细胞核并整合在细胞染色体中，这种整合的病毒称为原病毒。在原病毒的两端各有一长末端重复序列（LTR）,LTR内侧还有为复制所必需的其他顺序，包括包装信号。目前常用的逆转病毒载体有CMV和SV。、2、DNA病毒载体主要有腺病毒相关病毒载体，疱疹病毒载体。这一类是利用病毒载体介导的基因转移，以其高转染率和良好的靶向性成为肿瘤基因治疗的有效方法。对DNA病毒载体的研究是当前基因治疗研究中的重点领域。病毒载体转染过程三、转染的基本过程转染与分析靶基因质粒DNA的准备靶细胞的准备、被用于作靶基因转染的细胞，其生长状态如何，将直接决定了基因转染效率。如为贴壁生长的细胞，一般要求在转染前一日，必需应用胰酶处理成单细胞悬液，重新接种于培养皿或瓶，细胞密度以铺满培养器皿的60%为宜，转染当日，在转染前4小时换一将近新鲜培养液。对于悬浮细胞，也需在转染前4小时换一次新鲜培养液。（一）靶细胞的准备、用于转染的质粒DNA必须无蛋白质，无RNA和其它化学物质的污染，OD260/280比值应在1.8以上。DNA的质量和纯度能影响某些细胞系的转染效率，可以通过CsCl梯度法或标准柱层析法进行纯化。（二）靶基因质粒DNA的准备、具体的基因转染条件应参考所使用的试剂和方法进行优化。靶基因被导入细胞后，一般在转染后24小时，靶基因即在细胞内表达。根据不同的实验目的，48小时后即可进行靶基因表达的检测等实验。如若建立稳定的细胞系，则可对靶细胞进行筛选，根据不同基因载体中所含有的抗性标志选用相应的药物，最常用的真核表达基因载体的标志物有潮霉素（hygromycin）和新霉素（neomycin）（三）转染与分析、在目前的技术状态下，基因转染效率很难达到100﹪。故必须首先将转导细胞和未转导的细胞加以区分。这样的新技术发展很快，常用的转导细胞筛选方法：1.利用基因表达产物筛选法（1）标记基因筛选法在载体上引入一个标记基因，或同时导入标记基因，在转染后的适当时间选用合适剂量的选择培养基，筛选标记基因表型，那些已导入外源基因的细胞将存活下来。、（2）基因缺陷型受体细胞的选择性以基因缺陷型细胞作为靶细胞，将正常基因导入基因缺陷型靶细胞后，使用选择性培养基进行筛选。（3）基因共转染技术将目的基因表达载体DNA和标记基因表达载体DNA混合后共同转移到靶细胞中，分别使用标记基因和目的基因对应的选择剂进行两次筛选，最后得到复合转导的转化子。、2.分子生物学方法外源基因是否真的转入靶细胞必须用分子杂交方法进行证实。常用的方法有原位杂交、Southern杂交。其中主要问题是探针的选择。、在筛选出转化子后还需要鉴定转导细胞中外源基因的表达状况。其中包括对目的基因和标记基因的鉴定。常用方法有原位杂交、Northern杂交、免疫组织化学染色等，原位及Northern杂交是检测外源基因转录出的mRNA,后者则是检测外源基因翻译出的蛋白质。四、外源基因的表达和检测、1、用于建造疾病的动物模型和药物筛选模型2、用于基因治疗3、用于异种器官移植4、用于改良动植物品种和生产性能5、用于生产药用蛋白和保健蛋白6、用于生产人抗体五、主要应用5.各种转染方法比较转染方法原理应用特点电穿孔法细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中，将诱导沿细胞膜的电压差异，这种电压差异会导致细胞膜暂时穿孔。稳定转染瞬时性转染所有细胞适用细胞广，但细胞致死率高，DNA和细胞用量大，需根据不同细胞类型优化实验条件显微注射法或基因枪法使用一根细针头将DNA，RNA或蛋白直接转入细胞质或细胞核；基因枪使用高压microprojectile将大分子导入细胞。稳定转染瞬时性转染所有细胞适用细胞广，细胞致死率高，操作复杂病毒介导法通过侵染宿主细胞将外源基因整合到染色体中稳定转染瞬时转染特定宿主细胞可用于难转染的细胞；但携带基因不能太大；需考虑安全因素磷酸钙法磷酸钙DNA复合物吸附细胞膜被细胞内吞。稳定转染瞬时性转染不适用于原代细胞；操作较简便但重复性差细胞毒性较大；效率较低DEAE葡聚糖转染法抑制核酸酶内吞作用瞬时表达操作相对简单；但需高浓度DNA；DEAE葡聚糖浓度；温育时间阳离子脂质体法带正电的脂质体和核酸带负电的磷酸基团形成复合物被细胞内吞。稳定转染瞬时性转染适用细胞广；转染效率高，重复性好但转染时需除血清和抗生素；相对具有一定毒性阳离子聚合物阳离子聚合物与核酸等形成稳定的复合物被细胞内吞稳定转染瞬时性转染为最新一代的转染试剂，具有操作简单；稳定性好；转染效率高，细胞毒性低的特点；通过调节聚合物/DNA比例优化实验。5.各种转染方法比较转染方法原理应用特点电穿孔法细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中，将诱导沿细胞膜的电压差异，这种电压差异会导致细胞膜暂时穿孔。稳定转染瞬时性转染所有细胞适用细胞广，但细胞致死率高，DNA和细胞用量大，需根据不同细胞类型优化实验条件显微注射法或基因枪法使用一根细针头将DNA，RNA或蛋白直接转入细胞质或细胞核；基因枪使用高压microprojectile将大分子导入细胞。稳定转染瞬时性转染所有细胞适用细胞广，细胞致死率高，操作复杂病毒介导法通过侵染宿主细胞将外源基因整合到染色体中稳定转染瞬时转染特定宿主细胞可用于难转染的细胞；但携带基因不能太大；需考虑安全因素磷酸钙法磷酸钙DNA复合物吸附细胞膜被细胞内吞。稳定转染瞬时性转染不适用于原代细胞；操作较简便但重复性差细胞毒性较大；效率较低DEAE葡聚糖转染法抑制核酸酶内吞作用瞬时表达操作相对简单；但需高浓度DNA；DEAE葡聚糖浓度；温育时间阳离子脂质体法带正电的脂质体和核酸带负电的磷酸基团形成复合物被细胞内吞。稳定转染瞬时性转染适用细胞广；转染效率高，重复性好但转染时需除血清和抗生素；相对具有一定毒性阳离子聚合物阳离子聚合物与核酸等形成稳定的复合物被细胞内吞稳定转染瞬时性转染为最新一代的转染试剂，具有操作简单；稳定性好；转染效率高，细胞毒性低的特点；通过调节聚合物/DNA比例优化实验。LOGO