5_第四章DNA损伤、修复及重组[兼容模式]

第四章DNA损伤、修复及重组第一节DNA的损伤DNA通过半保留复制的机制保证代谢上的稳定性。但稳定是相对的，从进化的角度上看，DNA是处于不断的变异和发展之中。DNA损伤：正常DNA分子的化学结构或物理结构在某些物理因素、化学因素以及细胞自发产生的毒素等干扰作用下发生改变的现象。（一）DNA的自发性损伤脱嘌呤和脱嘧啶碱基的脱氨基作用碱基的互变异构体细胞正常代谢产物对DNA损伤（二）物理因素包括X‐、α‐、β‐、γ‐、UV1、直接作用：电离射线（ionizing radiation）使DNA失去电子，引起DNA发生广泛的化学变化；非电离射线（non ‐）引起原子振动或促使电子进入较高能级，导致形成新的化学键。如UV可使DNA形成胸腺嘧啶二聚体2、间接作用：辐射首先作用于遗传物质以外的物质，使这些物质发生变化，然后由这些变化的物质再作用于遗传物质，引起一系列的遗传学效应。Deamination-oxidationU.V.CUAU.V.H2OH++OH-CCA（三）化学诱变因素（chemical~）碱基类似物（baseanalog）碱基修饰剂（basemodifier）嵌入染料（intercalatingdye）碱基类似物（baseanalogs）5-BrU：T类似物BrBr转换5－BrU的酮式和烯醇式具有不同的配对特性AT5-BrU(k)G5-BrU(e)CmispairingmispairingTA5-BrU(k)GC5-BrU(e)AGGAReplicationerrorIncorporationerror5-BrU(k)5-BrU(e)2－氨基嘌呤的不同配对特性AP：A类似物，ATGCGCAT(k)(e)TC亚硝酸（Nitrous acid，NA）：脱氨基作用；ACGI＝CU=AX=CdeaminationHNO2羟胺（NH2OH，HA）：特殊的点突变诱变剂，使C→HC(4－羟胺胞嘧啶)＝A，结果诱发GC→AT的转换碱基修饰剂（basemodifier）AT→GCGC→AT烷化剂（alkylating agents）：一类带有单/多个不稳定的烷基，可将烷基加入到核酸上各种位点的亲电化学试剂。EMS（Ethylmethanesulfonate）已基甲烷磺酸CH3-S-O-CH2CH3OOMMS（methylmethanesulfonate）甲烷磺酸甲酯CH3-S-O-CH3OOSM（SulfurMustardsgas）硫芥HSCH2CH2ClCH2CH2ClAO（AcridineOrange）吖啶橙扁平分子EB（EthidiumBromide）溴化乙锭-ATTTTTCG--TAAAAAGC--ATTTCG--TAAAGC-TAOT-ATEBTTTTCG--TA分子插入AOEB-ATTTCG--TAAAGC--ATX’TTTTCG--TAXAAAAGC-XAAAAGC-吖啶染料：美国癌症研究所以吖啶分子为基础，人工合成的一类诱变剂。嵌入染料（intercalatingdye）遗传信息发生错误的原因：一些理化因子作用于DNA，改变碱基结构；DNA在复制过程中发生错配；DNA重组；外源基因的整合。保证遗传稳定的机制--DNA修复第二节DNA修复(DNArepairing)•是细胞对DNA受损伤后的一种反应，这种反应可能使DNA结构恢复原样，重新能执行它原来的功能；但有时并非能完全消除DNA的损伤，只是使细胞能够耐受这DNA的损伤而能继续生存。非诱导修复诱导修复DNA修复直接修复切除修复重组修复错配修复光复活修复烷基的转移单链断裂的重接避免差错修复易错修复phR471aa1、直接修复（directrepair）光复活修复（photoreactivation）----TT--------AA--------TT--------AA--------TT--------AA--------TT--------AA----•Beforereplication•400nmBluelight&•photo-reactivationenzyme）可见光激活光复活修复只能修复嘧啶二聚体.•ThepyrimidinedimerblocksDNAreplication•高等哺乳动物该功能退化了。•例：对细菌紫外诱变或杀灭时尽量保持暗环境切口的重接：DNA连接酶（ligase）修复。烷基的转移：O6甲基-G-甲基转移酶（MGMT)，单加氧酶(依赖于α-酮戊二酸和Fe2+)(AlkB)2、切除修复（excisionrepair）碱基切除修复（Baseexcisionrepair）U和烷基化的碱基可被糖苷酶(glycosylases)直接从DNA上切除BeforeReplication，暗修复核苷酸的切除修复(Nucleotideexcisionrepairsystems)切除包括损伤碱基的一段序列short-patchrepair(12nt)long-patchrepair(1500)9000ntEnzymes:•核酸内切酶•核酸外切酶•DNA聚合酶•DNA连接酶TheUvrsystem3‘-65’－223’－（3-4）5‘-73、重组修复（recombinationrepair）实质：并非修复，而是“稀释”。DNApolymeraseligaseMCE（mismatchcorrectenzyme）3subunitsmutH,L,Sdamgenem6A甲基化酶Scanning新生链中错配碱基识别新生链中非m6A的GATC序列酶切含错配碱基的新生DNA区段4、错配修复（mismatchrepair）应急反应（SOS）：由DNA损伤或抑制复制的处理所引起的一系列复杂的诱导效应。SOS诱导的修复作用：A.errorfreerepair（避免差错修复）：修复过程中错配碱基通常被切除，修复后DNA恢复正常。B.error-pronerepair（易错修复）：DNA受到严重损伤、细胞处于危急状态时所诱导的一种DNA修复方式，修复结果只是能维持基因组的完整性，提高细胞的生成率，但留下的错误较多，故又称为错误倾向修复.5、应急反应和诱导修复JeanWeagleE.coliE.colialive8010Mut.90%10%•DamagedDNAofλ-phageberepairedmoreinE.coliA•SOSrepairinE.colihavetobeinducedbyU.V.（A）•HighfrequencymutationbySOSrepair（Error-prone）ABLexA可抑制许多基因的表达，包括修复、recA和lexA。RecA激活启动了LexA的降解，进而诱导了许多基因的表达DNAdamaged300XsignalRecAcleavesLexASOSU.V.damageDNASignal（S.S.DNAtail/5NtS.S.DNA）机制RecA的功能：●与S.S.DNA结合活性●对少数蛋白的proteinase活性●DNA重组活性当DNA正常复制时（无复制受阻，无DNA损伤，无TTdimer）RecA不表现proteinase活性当DNA复制受阻/DNAdamaged能量大量消耗细胞内原少量表达的RecA与S.S.DNA结合激活RecA的proteinase活性修复损伤LexA降解RecA高效表达300XSOSopen当DNA复制度过难关后SOSrepair是一种error-prone极强的修复机制是进化中形成的“竭尽全力，治病救人”的措施（正常状态下，SOS是关闭的）RecA很快消失lexAgeneonSOSoff总结：变异的形成DNA未经修复经过修复/校正死亡突变率降低差错倾向修复（SOS）避免差错修复（光修复，切除修复,错配修复，重组修复）形成变异不形成变异DNAdamaged/mispairing人工诱变，自发突变变异是在修复过程中形成的不准确的修复第三节基因突变与生物进化突变(mutation): DNA碱基序列水平上发生的永久性的、可遗传的变异。一、突变的类型根据突变发生的原因：自发突变（spontaneous ~）：由于外界环境的自然作用或生物体内生理生化变化而诱发的突变（碱基错配（复制）、碱基之间的互变异构、碱基脱氨基、脱嘌呤或脱嘧啶、活性氧引起的诱变）人工诱变（Induced mutations）：由于人工特设的诱发因素而引起的突变。根据突变的机理：碱基对的置换（substitution）或点突变（point mutation）：一个单一碱基的改变。转换（transition）：DNA分子中的嘌呤为另一种嘌呤或嘧啶被另一种嘧啶取代而引起的突变；颠换（transversion）：DNA分子中嘌呤被嘧啶所取代或嘧啶被嘌呤所取代而引起的突变；transitionPyPyPuPutransversionPyPu点突变的效应：无义突变（nonsense ~）：使氨基酸密码子转变为终止密码子（UGA、UAG、UAA）的突变.错义突变（missense ~）：三联体密码子发生突变导致蛋白质中原来的氨基酸被另一氨基酸取代同义突变（samesense ~）：虽然三联体密码子发生突变，但仍然编码同一种AA。终止密码子起始密码子插入或缺失突变（insertions/deletions）：DNA分子中插入或缺失一个或少数几个核苷酸突变效应：•插入或缺失几个氨基酸：•移码突变（frameshift）：DNA分子中插入或缺失非3n个核苷酸，使整个阅读框改变而引起的突变。突变的意义：进化的分子基础遗传多态性致死突变可以消灭有害病原体创造新类型物种是某些疾病的病因第三节重组（Recombination）突变是进化的物质基础突变（+重组）→ 可遗传的变异→ 遗传漂变（genetic drift）、自然选择（natural selection）→进化重组是进化的必要条件迅速增加群体的遗传多样性；使有利突变与不利突变分开；通过优化组合积累有意义的遗传信息。一、同源重组(Homologous Recombination)1、定义：两条同源区的DNA分子，通过配对、链的断裂和再连接，而产生片段交换的过程。2、特点：发生在同源染色体/同源序列（75bp）之间；较大片段的交换；交换位点可以在同源区的任何位置上；十分精确，无核苷酸的缺失、获得和改变。3、holliday模型①两个同源染色体DNA排列整齐；②一个DNA的一条链断裂并与另一个DNA对应的链连接，形成连接分子，即holliday中间体；③通过分支迁移产生异源双链DNA；④holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA。如切开的链与原来断裂的是同一链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA，称为片段重组体。如切开的链非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA，称为拼接重组体。问题：难以设想模型认为的两个DNA能在同一位置发生断裂。Moselson提出修正，认为同源DNA分子中只有一个分子发生单链断裂，随后单链入侵另一个DNA分子的同源区，造成链的置换，被置换的链再切断并与最初断链连接，即形成Holliday中间体。⑦相应的迁移形成双个交叉4、双链断裂启动重组⑧在两个交叉之间，由交换和分支迁移产生的是异源双链，由修复合成产生的是同源双链。①双链断裂；②产生3’末端的单链；③单链攻击；④修复合成与链置换⑤被置换的链迁移到另一双螺旋；⑥修复合成，缺口被供体序列置换5.E.coli中与DNA同源重组有关的酶chi位点可被几kb处的双链断裂所激活引起重组chi位点是RecBCD蛋白的靶标5’-GCTGGTGG-3’3’-CGACCACC-5’5.1RecA蛋白：可诱发SOS反应和促进DNA单链的同化。单链同化：指单链与同源双链分子发生链的交换，单链同化是在螺旋状纤丝中进行的。RecA蛋白介导的DNA链交换过程为：RecA蛋白与单链DNA结合形成螺旋状纤