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第十二章细胞衰老与凋亡CellSenescenceandApoptosis人体细胞的动态分类•更新组织：如上皮细胞、血细胞。构成更新组织的细胞可分为3类：①干细胞、②过渡细胞、③成熟细胞。•稳定组织：可补偿性增生，如：肝、肾细胞。•恒久组织：细胞不再分裂，如神经细胞。•可耗尽组织：如人类的卵巢实质细胞。老年人体内有幼嫩细胞吗？有幼嫩的细胞，如精原细胞、造血干细胞有衰老的细胞，如皮肤表皮细胞衰老成角质层细胞，最后凋亡。年轻人有衰老细胞吗？第一节细胞衰老Aging，Senescence，指细胞随着年龄增加，机能和结构退行性变化，趋向死亡的不可逆现象。衰老是生命的普遍现象，发生在生态系统、群落、种群、个体、细胞以及分子等不同层次。一、早期的细胞衰老研究二、Hayflick界限100多年前，魏斯曼曾提出种质不死而体质会衰老和死亡的学说。后来，Carrel和Ebeling认为细胞本身不会衰老，衰老是由于环境的影响造成的。特别是20世纪40-50年代，由于L系小鼠细胞和Hela细胞系的建立，又使细胞不死性的观点更加巩固。直到20世纪60年代初，Hayflick等人的出色工作彻底动摇了细胞不死的观点。1、Hayflick界限：细胞，至少是培养的细胞，不是不死的，而是有一定的寿命；它们的增殖能力不是无限的，而是有一定的界限。2、实验证明：（1）Hayflick等以1：2的比率连续进行细胞传代，发现平均只能传代40~60次，此后细胞就逐渐解体并死亡。（2）Hayflick等从胎儿肺得到的成纤维细胞可在体外条件下传代50次，而从成人肺得到的成纤维细胞只能传代20次，可见细胞的增殖能力与供体年龄有关。体外培养的年轻和老的人成纤维细胞的显微形态左边是只分裂了几代的年轻成纤维细胞，呈现薄层、细长的形态；右边是分裂了50次的老的成纤维细胞，开始衰退，并很快死亡。（３）Goldstein选用了早老症（Hayflick-Guilford综合症）及Werner氏综合症患者的成纤维细胞进行培养，从患者身上得到的成纤维细胞在体外只能传2~4次，其DNA合成亦较少，且细胞表面不具有正常成纤维细胞所具有的HLA抗原标记。Werner’ssyndrome•Hutchinson-Gilfordsyndrome（４）Hayflick还比较了取自寿命长度不同的生物的胚成纤维细胞在体外培养条件下的传代数和寿命，发现物种寿命与培养细胞寿命之间存在着确定的相关关系，例如，Galapagos龟平均最高寿命最长，达175岁，其培养细胞的传代数亦最多，达90~120次；小鼠平均最高寿命为3.5年，其培养细胞的传代数就较少，仅14~28次。３、决定细胞衰老的因素为了确定培养的人二倍体细胞的衰老是细胞本身决定的还是由于培养环境的恶化，Hayflick设计了巧妙的实验：取老年男性个体的细胞（间期无巴氏小体）和年轻女性个体的细胞（间期有巴氏小体）进行单独或混合培养，并统计其倍增次数。结果发现，混合培养中的两类细胞的倍增次数与各自单独培养时相同，即在同一培养液，当年轻细胞旺盛增殖的同时，年老细胞就停止生长了。这一结果有力地说明，决定细胞衰老的因素在细胞内部，而不在外部环境。年轻细胞的胞质体与年老的完整细胞融合时，得到的杂种细胞不能分裂；年老细胞的胞质体与年轻的完整细胞融合时，杂种细胞的分裂能力几乎与年轻细胞相同。充分说明决定细胞的衰老是细胞核，而不是细胞质。二、细胞在体内条件下的衰老•在机体内，细胞的衰老和死亡是常见的现象，甚至在个体发育的早期也会发生;•正常情况下终生保持分裂的细胞，其分裂能力是否随着有机体年龄的增高而下降？它们会不会衰老？◆衰老动物体内，细胞分裂速度显著减慢，其原因主要是G1期明显延长;◆衰老个体内的环境因素影响了细胞的增殖和衰老;◆骨髓干细胞移植实验说明随着年龄的增加，干细胞增殖速度也趋缓慢。三、衰老细胞结构的变化•细胞核的变化•内质网的变化:衰老动物内质网成分弥散性地分散于核周胞质中，粗面内质网的总量似乎是减少了；•线粒体的变化:通常，细胞中线粒体的数量随年龄增加而减少，体积则随年龄增加而增大。•致密体的生成•膜系统的变化细胞核的变化•体外培养的二倍体细胞，细胞核随着细胞分裂次数的增加不断增大•细胞核的核膜内折（invagination）、染色质固缩化膜系统的变化•衰老的细胞，其膜流动性降低、韧性减小•衰老细胞间间隙连接明显减少;细胞膜P面的膜内颗粒在年老细胞中明显减少，而E面颗粒相对增加核增大、染色深、核内有包含物染色质凝聚、固缩、碎裂、溶解质膜粘度增加、流动性降低细胞质色素积聚、空泡形成线粒体数目减少、体积增大高尔基体碎裂尼氏体消失包含物糖原减少、脂肪积聚核膜内陷总结：细胞衰老的特征形态学分子水平的变化1.DNA：复制与转录受阻，端粒DNA、mtDNA缺失。DNA氧化、断裂、缺失和交联，甲基化程度降低。2.RNA：含量减少。3.蛋白质：含成下降，发生修饰、交联。4.酶分子：物理与化学特征改变，酶失活。5.脂类：不饱和脂肪酸被氧化。四、细胞衰老的分子机理1.代谢废物积累：如：脂褐质，老年性痴呆（AD）脑细胞内的β-淀粉样蛋白。2.线粒体DNA突变：线粒体自由基浓度高，mtDNA是裸露分子，容易发生突变。•脑、心、骨骼肌的氧负荷最大，组织最易衰老。•caloricrestriction能延长大鼠寿命50%-70%。Thinratvs.fatratTheratsareboth1000daysold,veryoldforrats.Theoneontherightwascalorierestricted.Theoneontheleftisneardeathandshowstypicalsignsofoldagesimilartowhathappensinhumans.（ImagecitedfromCliveMcCay1939）3．自由基学说（freeradicaltheories）•自由基是含不成对电子的原子或基团，具有高度反应活性。包括：氧自由基（如·OH）、氢自由基（·H）、碳自由基、脂自由基等。•自由基来源：外源性（如辐射）、内源性。•内源性自由基产生于①由线粒体呼吸链电子泄漏产生；②由氧化酶（如MFO）催化底物羟化产生。•自由基可引起DNA、蛋白质、脂类氧化、变性和交联，实验表明DNA中OH8dG随着年龄而增加。•正常细胞内存在清除自由基的防御系统。–酶系统：SOD、CAT、GSH-PX。–非酶系统：维生素E、醌类电子受体•Orr和Sohal（1994），将SOD基因导入果蝇，其寿命比野生型延长1/3。4．程序性衰老（programmedsenescence）•生物的生长、发育、衰老和死亡都由基因程序控制的，衰老是某些基因依次开启或关闭的结果。例1.在小鼠肝中，胚胎早期表达的胞质丙氨酸转氨酶（cAAT）为A型，随后停止表达，衰老时则表达B型cAAT。例2.肝脏中的衰老标志蛋白2在老年期表达。5．复制性衰老（replicativesenescence）•细胞的增殖次数是有限的，称“Hayflick”极限。如人胚成纤维细胞可培养60-70代。•DNA每复制一次端粒就缩短一段，到一定程度时，则激活DNA损伤检验，细胞凋亡。人的成纤维细胞端粒每年缩短14-18bp。•端粒酶可修复端粒，此酶仅在干细胞、精原细胞和肿瘤细胞中表达。6.衰老基因学说•子女的寿命与双亲的寿命有关；动物都有相当恒定的平均和最高寿命；•成人早衰症：约39岁衰老，47岁生命结束；婴幼儿早衰症：1岁衰老，12~18岁生命结束；–早衰症患者体内解旋酶发生突变。•衰老时，衰老相关基因（SAG）活跃表达，如senescentcellderivedinhibitionofDNAsynthesis。第二节细胞坏死与凋亡细胞死亡并非与机体死亡同步。正常的组织中也发生细胞死亡，它是维持组织机能和形态所必需的。一、细胞死亡的方式（一）细胞坏死•细胞受到环境因素伤害，引起细胞死亡的现象。•形态变化的原因：酶性消化、蛋白变性。•如消化酶来源于死亡细胞本身的溶酶体，则称为自溶（autolysis）；若来源于浸润坏死组织内白细胞溶酶体，则为异溶（heterolysis）。•细胞坏死初期，胞质内线粒体和内质网肿胀、崩解，结构脂滴游离、空泡化，蛋白质颗粒增多，核发生固缩或断裂。•随坏死进程，细胞质呈强嗜酸性，苏木精/伊红染色呈均一红色。•细胞膜不完整，台盼蓝染色阳性（活细胞不着色）。•DNA随机降解，细胞内容物流出，引起炎症。（二）细胞凋亡①细胞通过出芽的方式形成许多凋亡小体；②凋亡小体内有结构完整的细胞器；③不引起炎症；④线粒体无明显形态变化，溶酶体活性不增加；⑤内切酶活化，DNA有控降解，凝胶电泳图呈梯状；⑥凋亡通常是生理性变化，坏死是病理性变化。正常胸腺细胞凋亡正常胸腺细胞凋亡（三）细胞程序性死亡细胞程序性死亡（PCD）是一种基因指导的细胞自我消亡方式。•PCD和细胞凋亡的区别在以下方面：•PCD是功能性概念，凋亡是形态学概念。•PCD的最终结果是凋亡，但凋亡并非都是程序化的。•PCD存在于胚胎发育过程中。C.elegans是研究PCD的理想材料（生命周期短，细胞数量少）。•C.elegans雄虫有1031个体细胞、约1000个生殖细胞。•神经系统由302个细胞组成，来自于407个前体细胞，105个细胞发生了PCD。•控制线虫PCD的基因有：Ced-3、Ced-4和Ced-9。–Ced-3和Ced-4诱发凋亡；–Ced-9抑制Ced-3、Ced-4的作用。2002年10月7日英国人Sydney、美国人Horvitz和英国人Sulston，因在PCD方面的研究获诺贝尔诺贝尔生理与医学奖。H.RobertHorvitzJohnE.Sulston•SydneyBrenner二、细胞凋亡的生理和病理学意义（一）生理学意义1.生长发育：组织与器官的塑造（趾的分化）；动物变态；皮肤角质形成；2.免疫细胞分化：克隆选择；3.防御：清除衰老细胞、DNA损伤的细胞和被病原体感染的细胞。•Sculptingthedigitsinthedevelopingmousepawbyapoptosis（Wood2000）（二）病理学意义1.病原体侵染；–诱导凋亡——HIV–抑制凋亡——Poxvirus2.细胞凋亡不足–肿瘤，自身免疫疾病；3.细胞凋亡过度–神经退行性疾病（AD，帕金森症）、心肌梗塞、再生障碍性贫血、骨组织坏死。三、细胞凋亡的检测方法1.形态学，电镜，光镜；2.DNA凝胶电泳——ladder；3.流式细胞仪；4.核酸内切酶活力检测；5.免疫学方法；6.AnnexinV检测细胞膜外表面PS；7.TUNEL技术。8.常用检测细胞凋亡的染料：•二乙酸荧光素（FDA），绿色荧光，活细胞染色。•Hoechst33342或33258，DAPI，吖啶橙（AO），半通透，凋亡和固定后的细胞荧光较强。•溴化乙啶（EB）、碘化丙啶（PI）、放线菌素D（7-AAD），不通透，正常和凋亡细胞拒染。•可用不同性质的染料对凋亡细胞进行双染色。Humanembryoatday4containing23nucleilabelledwithDAPI(blue),includingsevenTUNEL-labelledcondensednuclei(pink,arrow)thatwereexcludedfromdevelopment(KateHardy1999).第三节细胞凋亡的分子机理一、凋亡相关的基因和蛋白•与细胞增殖有关的原癌基因和抑癌基因都参于对细胞凋亡的凋控。•研究较多的有ICE、Apaf-1、Bcl-2、Fas/APO-1、c-myc、p53、ATM等。1．Caspase家族相当于线虫的ced-3，是引起凋亡的关键酶。特点：①酶活性依赖于cys残基的亲核性；②总是在asp之后切断底物，故名caspase（cysteineaspartate-specificprotease）。③亚基由同一基因编码，前体被切割后产生两个活性亚基，组成的异四聚体。Caspase