7七DNA的重组与转座改

1第七章DNA的重组与转座生物技术专业任林柱[e-mail]分子生物学Copyright©2012byRENLINZHU.Allrightsreserved.2一.DNA的重组二.DNA的转座本章主要内容3◘生存→变异→突变，重组损伤修复、适应环境、加速进化第一节DNA重组4◘DNA重组：DNA分子内或分子间发生的遗传信息的重新组合.又称遗传重组或基因重排.(recombination)5DNA重组的意义:•能迅速增加群体的遗传多样性(diversity)，使有利突变与不利突变分开，通过优化组合(optimization)积累有意义的遗传信息。•此外DNA重组还参与许多重要的生物学过程。它为DNA损伤或复制障碍提供了修复机制。6重组是遗传学的灵魂，没有重组就没有生物的进化；没有重组也就没有现代的分子克隆技术!7同源重组(homologousrecombination)位点特异的重组(site-specificrecombination)转座重组(transpositionrecombination)81同源重组9同源重组（homologousrecombination）:又称一般性重组,由两条同源区的DNA分子,通过配对、链断裂和再连接，而产生的片段间交换的过程.1.1概念及特征特征：◘涉及同源序列间的联会配对(四联体)，且交换的片段较大（相似或相同片段、碱基配对）----有同源序列,紧密接触◘涉及DNA分子在特定的交换位点发生断裂和错接的生化过程.异源双链区的生成◘需要重组酶10联会：同源染色体两两配对的现象。11四分体：联会后的每对同源染色体含有四条染色单体，叫一个四分体。121.2同源重组的机制1.2.1断裂复合及Holliday中间体的形成◘1964年,Holliday提出了同源重组的模型.Holliday模型的四个关键步骤：①两个同源染色体DNA排列整齐；②一个DNA的一条链断裂并与另一个DNA对应的链连接，形成的连接分子，称为Holliday中间体；③通过分支移动产生异源双链（heteroduplex)DNA；④Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA。1314◘Holliday结构同源重组中连接两个DNA双链的交换中间物,含有4股DNA链，在连接处为了转换配对所形成交叉链的连接点,这种结构称…◘Holliday结构形成的分子机制（断裂复合起始机制）同源重组都涉及到DNA分子内的－－断裂—复合15161.2.2分枝迁移和Holliday结构的拆分◘分枝迁移（branchmigaration）－－双螺旋形成的交叉连接以拉链式效应扩散的过程.17Holliday的异构化产生重组体的拆分Holliday结构一经生成即可不断地处于异构化－－异源双链heteroduplexDNA重组结果取决于拆分时配对链上的切口位置18片段重组体(patchrecombinant,见模型图左边产物）：切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA。拼接重组体(splicerecombinant,见模型图右边产物）：切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA。◘Holliday结构的拆分19内切酶(recBCD)DNA侵扰(recA)分支迁移(recA)内切酶(recBCD)DNA连接酶5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´3´3´5´3´5´3´3´5´5´3´5´3´5´3´Holiday中间体5´3´5´3´5´3´5´3´目录20Holiday中间体5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´5´5´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´内切酶(ruvC)内切酶(ruvC)DNA连接酶DNA连接酶拼接重组体片段重组体目录21（1）（2）（1）（2）产生含异源双链的亲本DNA分子即片段重组体产生拼接重组体222、双链断裂模型Doublestrandedbreakrepairpathway双链断裂修复途径2324253.1RecA蛋白（1）活性a、RecA有单、双链DNA结合活性b、RecA有NTPase活性（底物差异活性）与单链DNA结合时活性最大---依赖于DNAc、RecA具有使DNA单链置换双链中同源链的能力（但其靶DNA必须有缺口－－结合DNA）（2）主要功能:a、诱发SOS反应b、促进DNA单链的同化（assimilation）或单链吸收3、与DNA重组有关的酶及蛋白26单链同化是指单链与同源双链分子发生链的交换，从而使重组过程中DNA配对、Holliday中间体的形成，分支移动等步骤得以产生。RecA特异地识别单链DNA，并能将之与同源DNA中的互补链顺序“退火”，同时将另一条链排挤出去（取代），形成杂种分子。272829RecA入侵单链被置换连RecA引发链侵入模型3031RecApromotestheassimilationofinvadingsinglestrandsintoduplexDNAsolongasoneofthereactingstrandshasafreeend.RecA启动的单链入侵32单链同化发生的几个条件：（1）其中一个DNA必须存在单链区（2）其中一个DNA必须有一个自由3’末端33•RecA结合与组装到单链DNA上的速度远快于组装到双链DNA上的速度。•结合于3’端的速度远快于结合到5’端的速度。RecA组装的方向性34（3）RecA蛋白催化双链和单链DNA的反应阶段a、联会前阶段（缓慢）,RecA与单链结合b、单链与双螺旋的互补链迅速配对，形成双链连接分子Hollidayc、从双螺旋结构中缓慢置换一条链产生一段长的异源双链DNA反应结束时，RecA结合到双链上3536RecA引起的链交换和Holliday结构的生成37三种类似RecA的蛋白质。a.人类Rad51;b.大肠杆菌RecA;c.fulgidusRadA383.2RecBCD（外切核酸酶Ⅴ）◘具有ATP解旋酶（再旋）活性、可被ATP增强的内切核酸酶活性、依赖于ATP的外切核酸酶活性、◘单链内切酶活性和解旋酶活性使DNA产生具有游离3’末端的单链◘RecBCD有固定的切割位点☀chi位点：GCTGGTGG,目前发现的重组热点,E.coli中每隔约5~10kb有一个拷贝，约有1009个这样的位点。39chi位点的极性403‘◘RecBCD的识别和切割位点a、RecBCD结合在DNA的平头末端b、外切、解链、移动（ATP）c、RecBCD在chi位点3’方4～6nt处切断单链（单链内切酶）d、RecBCD切割产生3’单链末端41RecBCD作用于DNA的步骤42◘RecBCD和RecA的共同作用43内切酶(recBCD)DNA侵扰(recA)分支迁移(recA)内切酶(recBCD)DNA连接酶5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´3´3´5´3´5´3´3´5´5´3´5´3´5´3´Holiday中间体5´3´5´3´5´3´5´3´目录44Holiday中间体5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´5´5´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´内切酶(ruvC)内切酶(ruvC)DNA连接酶DNA连接酶片段重组体拼接重组体目录453.3原核同源重组的其它蛋白需要E.coli中三个基因ruvA,ruvB和ruvC的产物a、RuvA识别Holliday结构的连接点，4聚体b、RuvB为分枝迁移提供动力（ATPase10～20bp/s），6聚体c、RuvC核酸内切酶---专一性识别Holliday结构的连接点,体外切断连接点以拆分重组体,识别不对称的四核苷酸5’A/TTTG/C.d、DNA聚合酶和DNA连接酶进行修复合成46RuvA结构图和RuvAB复合体与Holliday联结体结合的模式图47RuvC结构图和Holliday联结体结合RuvC二聚体的模式图48◘E.coli重组修复的各阶段损伤DNA复制产生缺口RecA链交换第二次链交换DNApol通过DNA合成填满缺口RuvA,B分枝迁移RuvC切割Holliday连接点49•当复制叉遇到一个未修复的非编码的损伤，它能跳过DNA损伤区域，并继续复制，留下一个子链缺口，通过重组将亲本姐妹链上的相应区域替代并填平缺口。由此产生的亲本姐妹链上的缺口很容易被填平，因为它的对面没有损伤，原来损伤的部分可通过正常的切除去掉。这个机制也被称为复制后修复。50重组步骤大肠杆菌中的催化蛋白真核细胞中的催化蛋白同源DNA联会及链侵入RecA蛋白Rad51,Dcm1(减数分裂期)引入双链断裂无Spo11(减数分裂期)作用于DNA断端以产生用于侵入的单链RecBCD(解旋酶/核酸酶)MRX蛋白(又称为Rad50/58/60核酸酶)链交换蛋白组装RecBCDandRecFORRad52andRad59Holliday联合体识别和分支移位RuvAB未知拆分Holliday联合体RuvC可能是Mus81或其他蛋白质51真核细胞Spo11进行切割的机制52真核细胞减数分裂重组53544、细菌的基因转移与重组•细菌的基因转移主要有四种机制：接合(conjugation)、转化(transformation)、转导(transduction)和细胞融合(cellfusion)。•进入受体细胞的外源基因通常有四种结果：降解、暂时保留、与基因置换和发生整合。554.1接合作用（conjugation)当细菌的细胞通过菌毛相互接触时，遗传信息就可从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌），这种类型的DNA转移称为接合作用。供体细胞为雄性，受体为雌性。56质粒——细菌染色体外的小型闭合环状双链DNA分子57•通过接合而转移DNA的能力由接合质粒提供，与接合功能有关的蛋白质均由接合质粒所编码。•给体单链DNA进入受体细菌后转变为双链形式，584.2转化作用（transformation)1928,Griffith----1944,Avery证实转化的物质是DNA。II型无毒的粗糙型（无荚膜）III型有毒力的光滑型（有荚膜）59通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为转化作用(transformation)。6061•当游离DNA与细胞表面DNA结合蛋白相结合后，核酸酶使其中一条链降解，另一条链则被吸收，并与感受态特异蛋白相结合，然后转移到染色体上，参与DNA重组。也有些细菌能吸收双链DNA.•细菌广泛存在的自然转化现象，表明这是细菌遗传信息转移和重组的一种重要方式。•有些细菌在自然条件下不发生转化或转化效率很低，但在实验室中可以人工促使转化。具有摄取周围环境中游离DNA分子能力的细菌细胞称为感受态细胞(competentcell)。624.3转导作用转导作用(transduction):是通过噬菌体将细菌基因从供体转移到受体细胞的过程。63λ噬菌体的生活史例64•普遍性转导(generalizedtransduction)，是指宿主基因组任意位置的DNA成为成熟噬菌体颗粒DNA的一部分而被带入受体菌；•局限性转导(specializedtransduction)，是指某些温和噬菌体在装配病毒颗粒时将宿主染色体上整合部位的DNA包装进噬菌体蛋白质衣壳内,从而引起的转导现象。65664.4细菌的细胞融合在有些细菌的种属中可发生由细胞质膜融合导致的基因转移和重组。在实验室中，用溶菌酶除去细菌细胞壁的肽聚糖，使其成为原生质体，可人工促进原生质体的融合，由此使两菌株的DNA发生广泛的重组。两个细菌原生质体在聚乙二醇（PEG)作用