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CTC检测技术总结美国Affymetrix与Cytelligen公司正在联合开发的差减富集(SE)-iFISH-RNAFISH整合技术平台1.流式荧光检测仪——Luminex100™多功能流式点阵仪流式荧光技术，是基于美国Luminex公司研制的多功能流式点阵仪（Luminex100™）开发的高速度、高通量、并行检测的生物技术平台。它有机地整和了编码微球（color-codedbeads）、激光技术、应用流体学、最新的高速数字信号处理器和计算机运算法则，造就了其无与伦比的检测特异性和灵敏度，可广泛应用于免疫分析、核酸研究、酶学分析、受体和配体识别分析等研究，得到各权威机构和医学界高度认可，是临床诊断领域以及生命科学研究中的一大热点。流式荧光技术原理：该技术的核心是把微小的聚苯乙烯小球（5.6μm）用荧光染色的方法进行编码（微球的颜色是通过两种荧光染料染色得到的，调节两种荧光染料的比例可以获得100种不同颜色的微球），然后将每种颜色的微球（或称为荧光编码微球）共价交联上针对特定检测物的探针、抗原或抗体。应用时，先把针对不同检测物的编码微球混合，再加入微量待检样本，在悬液中靶分子与微球表面交联的分子进行特异性地结合，在一个反应孔内可以同时完成多达100种不同的生物学反应。最后用Luminex™100进行分析，仪器通过两束激光分别识别编码微球和检测微球上报告分子的荧光强度。因为分子杂交或免疫反应是在悬浮溶液中进行，检测速度极快，而且可以在一个微量液态反应体系中同时检测多达100个指标。本课题基于Luminex?100激光流式分析仪平台，建立可以同时检测乳腺癌患者外周血中8种循环肿瘤细胞基因(包括hMAM、HER2、CK-19、SBEM、EPG2、hTERT、β-HCG和B305D)表达水平的悬浮阵列方法，以探讨多基因联合检测在乳腺癌早期复发转移诊断中的应用价值。2.免疫磁珠分离细胞（MPC-Ⅰ型磁性细胞分离器MiltenyiBiotec，德国）传统细胞分离的方法有速度等密度沉降、等动力梯度沉降、差式沉降、离心洗提、双水相离和流式细胞仪等。与这些方法相比,免疫磁珠分离细胞具有如下优点:(1)可使目标细胞(targetcell)直接从原料液如血液、骨髓、组织匀浆、培养液中分离出来,具有简便、快速的特点;(2)和离心、过滤等方法相比,细胞在磁性分离时受到的剪切力小,可避免细胞的失活;(3)具有很高的选择性;(4)外加磁场不会对原料液中的离子和带电溶质的运动产生影响;(5)仪器设备简单,操作费用低。自1995年首次报道磁性激活细胞分选(magneticactivedcellsorting，MACS)技术的应用以来，许多研究表明它可从恶性肿瘤患者的外周血中分离出单个肿瘤细胞。该技术是一种理想的分离靶细胞的分选方法，它将抗原抗体反应的高度特异性和磁珠的富集分离作用相结合具备固相化试剂特有的优点以及免疫学反应的专一性，使其在临床医学诊断上具有广阔的应用前景。其基本原理在于用单抗与磁性微珠结合形成免疫磁珠，再与靶细胞上的抗原结合成靶细胞抗原-抗体-磁珠复合物，由于该复合物具有磁响应性，所以在外加磁场的作用下能向一定的方向移动，这样靶细胞就能同其他细胞分离开来。它可对肿瘤患者血中的肿瘤细胞进行富集、分离，结合免疫细胞化学技术能在106-107个单核细胞中分离检测出一个肿瘤细胞，可直观计数癌细胞并将假阳性降低，同时分离的细胞具有良好生物学活性，且具有较高的敏感性。3.基于免疫磁性分离原理发展起来的CellSearch系统是一种半自动化的CTC检测仪器，由Veridex公司(强生公司子公司)开发，只需应用7．5ml血液样本，即可从400多亿的血细胞中检测到一个CTC，敏感性较高。CellSearch系统的原理是上皮细胞来源的肿瘤细胞表面其上皮细胞粘附分子(epithelialcelladhesionmolecule，EpCAM)阳性，而血液细胞不表达EpCAM，依据此特点，将EpCAM抗体包被于磁珠表面，便可将CTC分离出来。CellSearch系统的基本流程是:先使用EpCAM抗体磁珠对上皮细胞进行富集，然后将细胞固定，用DAPI荧光核染料、CD45荧光抗体和CK8、CK18以及CK19荧光抗体标记细胞，再用半自动四色荧光显微镜CellSpotterAnalyzer进行分析，检测CK阳性、CD45阴性的上皮细胞，此即为CTC。CellSearch系统已被美国FDA批准应用于临床，目前主要应用于预测转移性乳腺癌、结直肠癌或前列腺癌的无病生存期和总生存期。临床应用结果表明，通过CellSearch系统检测CTC是传统医学影像学的有益补充，可借此有效评估患者的预后以及判断当前治疗方案的有效性。该方法简便、易行，而且可以对同一患者进行连续监测。目前CellSearch也逐步发展试用于检测其他肿瘤患者的CTC。采用免疫磁珠分离技术，去除肝癌患者外周血中的绝大多数白细胞，从而将血中剩余的稀有细胞包括肿瘤细胞进行富集，再利用免疫荧光技术对肿瘤细胞进行鉴别诊断。4.膜过滤方法免疫磁性分离技术(immunoma助etieseparation，IMs)、密度梯度离心法、膜滤过(isolationbysizeofepithelialtumorcells，ISET)等方法均广泛应用于CTC检测的研究，并且基于IMS方法的Cellsearch检测系统已经被美国FDA批准用于监测乳腺癌患者预后和治疗效果。继之，有关CTC临床价值的研究也取得了令人鼓舞的结果。已有临床研究证实乳腺癌患者CTc水平与无进展生存期(progression一freesurvival，PFS)及总生存期(overallsurviva一，0S)相关联。ISET联合激光扫描细胞计量仪(laserseanningeytometry，LSC)是近年来应用于CTe检测领域的一项新技术。IsET是根据肿瘤细胞体积大于外周血中粒细胞从而使肿瘤细胞从外周血中分离出来，然后应用LSC对已经标记荧光抗体的细胞进行扫描识别，从而可以准确计算出外周血中所含有的少量肿瘤细胞。该方法与Cellsearch检测系统相比，IsET细胞富集过程相对容易，是一种不依赖于相关抗原抗体反应而直接过滤外周血进行肿瘤细胞富集的技术，它减小了肿瘤细胞的丢失并不破坏肿瘤细胞的形态学特征，同时也在很大程度上提高了方法的敏感性。所以，IsET能从少量外周血中筛选出肿瘤细胞，并为下一步的形态学、细胞学以及分子生物学研究提供条件。并且该方法应用LSC可对所检测到的阳性细胞进行进一步目测确认，更加了CTC检测的准确性。有研究表明IMS方法的Cellsearch检测系统并不能识别所有类型的乳腺癌细胞，特别是normal一like型细胞[61，因为此型细胞表面并不表达EpcAM抗原分子。IsET联合Lsc检测CTC在国外报乳腺癌患者循环肿瘤细胞的检测及其临床应用引言道不多，在国内尚未见有报道。本科室前期实验已经开始初步探索应用ISET联合LSC检测CTC的方法，在该方法中我们应用各型肿瘤细胞均表达的特异性标记物一抗细胞角蛋白8(cytokeratinss，CKS)抗体，其检测方法的敏感性和特异性均较理想。5.目前血中CTC检测方法主要有两种:逆转录聚合酶联反应(RT-PCR)和免疫细胞化学法(ICC)。RT-PCR检测是通过扩增出肿瘤细胞相关或特异的转录标志物来证实肿瘤细胞的存在，该方法具有高效率、高灵敏度和特异性，操作简便，受主观因素影响较小，是目前检测CTC的有效方法之一。缺点是(l)假阳性率较高:由于基因的非法转录和活性假基因，正常粒细胞可表达部分细胞角蛋白如CKZO、CK19可在检测前去除粒细胞或采用定量PCR技术部分解决该问题。(2)细胞形态学被破坏，无法进一步判断和进行肿瘤细胞基因和转录组变化。(3)需要更严格的标本保存条件和实验条件。尽管RT-PCR技术敏感性高，但是由于检测背景信号的干扰导致的较高的假阳性率使该技术备受争议。纳米免疫磁珠分离技术结合ICc是常用的CTc检测方法之一，缺点是需经过红细胞裂解或淋巴细胞分离后提取单个核细胞，这两项操作均可造成靶细胞的丢失。vona等根据上皮肿瘤细胞的大小建立了一种简便、经济的方法分离计数CTC，即利用上皮肿瘤细胞比外周血细胞大的特点，通过过滤使之得到分离和富集，结合免疫细胞化学方法可敏感地检测CTC，该方法不需要单个核细胞的分离，减少了操作引起的靶细胞的丢失，操作步骤简单、价廉、费时少，能直接、快速分离多种肿瘤病人的CTC并保持细胞的完整状态，便于其他抗原的检测、细胞转录组和基因组的分析。6.CTC芯片2007年，美国麻省总医院癌症中心与强生公司合作，研发出一种能检测出血液中极微量癌细胞的微流体硅芯片，称为CTC－Chip。该芯片的表层排布了78000个包被抗体的微位点，当血液样本流过芯片时，该抗体可与肿瘤细胞相结合，肿瘤细胞就会因抗原－抗体反应而被粘附在芯片上。这种方法能在10亿个以上的血细胞中检出单个癌细胞，但仅可用于实验研究。2010年，该机构研发成功第二代CTC－Chip，称为HB－Chip(herringbone－chip)。与第一代CTC－Chip相比，HB－Chip的优点有:(1)芯片的表面形状从光滑改进为人字形交叉沟槽状，这样在血液样本流过芯片时会形成微漩涡，增加了与芯片表面所粘附抗体互相接触的机会，可更有效地捕获数量极少的循环肿瘤细胞。研究表明，HB－Chip可捕获血液样本中90%以上癌细胞，较CTC－Chip的分离效率提高25%。(2)HB－Chip能捕捉到CTC－Chip或其他CTC分离设备从没有发现过的肿瘤细胞团块。对这些癌细胞团块的进一步研究可能会对转移过程提供更深刻的理解。(3)该芯片安装了一个标准的载玻片，可以使用传统的病理检查方法来鉴别癌细胞。(4)更容易操作，而且可以处理更大容量的血液样本，因而能用于较大规模的临床研究。该项新技术为对肿瘤转移进行更为精细的分析提供了一个平台。7.应用激光扫描技术进行分离CTC。经常使用的荧光激活细胞分选器(fluorescenceactivatedcellsorter，FACS)是在流式细胞术基础上发展起来的。FACS集激光扫描技术、计算机技术、电子技术、流体力学、细胞免疫学和单克隆抗体技术等多种高新技术与方法为一体具有快速、准确的优点。其缺点是能否从血液中检测到肿瘤细胞很大程度上依赖于可分析的细胞数量，而肝癌外周血中CTC的数量常少于1/106，从而限制了该技术在肝癌CTC检测研究中的应用。如果在行FACS前将肝癌CTC进行富集，其敏感性将大为增高。8.根据细胞密度进行分离血液中各种细胞成份的密度不同，离心后在细胞分离液中会呈现梯度分布。利用此原理，将患者血液标本加入特定的细胞分离液后进行离心，即可分离出目标细胞。常用的细胞分离液有Ficoll液等，离心后，红细胞、中性粒细胞、单个核细胞(淋巴细胞、单核细胞、上皮细胞、肿瘤细胞)在试管中从下到上依次分布。使用OncoQuick离心分离管可提高分离效率。OncoQuick由无菌的离心管和一块多孔的隔栅及分离介质组成，抗凝全血可直接加入离心管，离心后肿瘤细胞会被富集到介质的上层。该法的局限性是敏感性低，分离出来的肿瘤细胞不纯，且有相当一部分肿瘤细胞丢失。