高效液相色谱法

第一节液相色谱仪器（highperformanceliquidchromatograph）液相色谱仪（1）液相色谱仪（2）液相色谱仪（3）液相色谱仪（4）Agilent1100系列高效液相色谱系统二、高效液相色谱法的特点（featureofHPLC）特点：高压、高效、高速、高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。高效液相色谱法与经典液相色谱法经典液相柱色谱装置高效液相色谱仪经典液相色谱HPLC固定相粒径流动相驱动方式流动相流速150-200μm重力或低压泵很慢3-10μm高压泵快(1-10mL/min)例：分离20种氨基酸柱长：170cm柱径：0.9cmF：30mL/ht分离:20h经典柱色谱HPLCt分离：1h慢中等快色谱分离Temporalcourse淋洗液液相色谱以液体为流动相，固定相可以是固体或液体（担载在固体表面），与气相色谱比，带来一系列变化：例如，填充柱气相色谱柱，一般填料的尺寸为80-100目，粒度大约是2毫米，而一般高效液相色谱的固定相粒度在2－10微米，因此流动相通过这样一段固定床时就产生了很高的反压。由于液体与气体性质的以下差异：•溶质在液体中的扩散系数比它在气体中小105倍左右•液体粘度比气体约大102倍•液体表面张力比气体大104倍左右•液体密度比气体约大103倍•液体不可压缩因此，我们通常所说的高效液相色谱，实际也是高压液相色谱，因为没有很高的压力就不可能产生很高的分离效率。三、流程及主要部件（processandmainassemblyofHPLC）1.流程（动画）2.主要部件(1)高压输液泵主要部件之一，压力：150～350×105Pa。为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（10μm），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性。(2)梯度淋洗装置外梯度:利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。内梯度:一台高压泵,通过比例调节阀，将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。(3)进样装置流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示：(4)高效分离柱柱体为直型不锈钢管，内径1～6mm，柱长5～40cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。(5)液相色谱检测器a.紫外检测器应用最广，对大部分有机化合物有响应。特点：灵敏度高；线形范围高；流通池可做的很小（1mm×10mm，容积8μL）；对流动相的流速和温度变化不敏感；•波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。一些常用溶剂的紫外截止波长溶剂CS2氯仿四氢呋喃苯乙睛甲醇水紫外截止波长/nm380245212210190205187b.光电二极管阵列检测器紫外检测器的重要进展；光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。光电二极管阵列检测器c.示差折光检测器（differentialrefractiveindexdetector）除紫外检测器之外应用最多的检测器；可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比；通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）；灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱；偏转式、反射式和干涉型三种。示差折光检测器d.荧光检测器（fluorescencedetector）高灵敏度、高选择性；对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应。§17-2基本理论一色谱柱柱效的基本关系式222/1'16'54.5WtWtnrreffeffeffnLH二分离度14)()(22112effrrnWWttR三速率方程CuuBAHMDB20uB在大多数情况下，溶质在液相流动相中的扩散系数，约为气相中扩散系数的万分之一CuAH流动相流速对板高的影响1)小颗粒填料，填充均匀；2)选择较低的流动相流速；3)选择粘度小的溶剂作流动相，改善传质。修正的速率方程：提高柱效途径硅胶－强极性氧化铝－弱极性活性炭－非极性分子筛－强极性高分子多孔微球(GDX)固体吸附剂§17-3高效液相色谱分离方法一(液-固)吸附色谱法1.吸附剂一般为多孔性的物质，在它们的表面存在着分散的吸附中心，溶质分子和流动相分子在吸附剂表面的活性中心上进行竞争，同时不同溶质之间和同一溶质的不同官能团之间也存在竞争。竞争的综合结果就是形成不同溶质在吸附剂表面吸附、解吸平衡。2分离原理nadnadadSXSXK]][[]][[X+nSadXad+SnKad值越大，保留时间越长。可表式为：吸附色谱的分离机理•随着样品在固定相上的吸附能力由大到小•在色谱柱上的保留由长到短硅胶表面结构硅胶表面结构经热处理发生的变化缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾。极性吸附剂上有机化合物的保留顺序如下：氟碳化合物饱和烃烯烃芳烃有机卤化物醚硝基化合物腈叔胺酯醛酮醇伯胺酰胺羧酸磺酸3流动相(洗脱剂)越大，表明流动相溶剂分子对吸附剂的亲和能力越强，则越易从吸附剂上将被吸附的溶质洗脱下来。。溶剂分子在单位吸附剂表面上的吸附自由能。溶剂强度参数各种不同极性的一元或多元溶剂。硅胶固定相分离苯，甲苯，乙苯，丙苯，丁苯流动相：干燥正庚烷1份水饱和的正庚烷2份干燥正庚烷水饱和的正庚烷改变流动相的组成可改变分离的选择性4应用具有不同官能团的化合物具有相同官能团，但数量不同的化合物异构体例：几种取代位置不同的硝基苯胺的分离。在硅胶吸附剂上的滞留顺序：邻位间位对位邻硝基苯胺间硝基苯胺对硝基苯胺适合分离的物质吸附色谱概述•分离基于样品的极性差异。•洗脱次序∶一般为正相，即：极性低的先被洗脱•常用的流动相∶–非极性有机溶剂，如己烷•常用固定相∶–硅胶、氧化铝。二分配色谱法1.分离原理msccKK不仅与固定相的种类有关，也与流动相的种类有关固定相与流动相均为液体（互不相溶）；分配色谱的分离机理固定相极性流动相极性正相分配色谱组分极性越大，保留时间越长反相分配色谱固定相极性流动相极性组分极性越小，保留时间越长2.流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相.即：当流动相的极性大于固定液的极性时：固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用；化学键合固定相：（将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。如C-18柱（反相柱）。（详见后面）分配色谱概述•反相色谱的主要类型，基于分子的极性分离•洗脱次序：一般为反相，即极性高的先被洗脱•常用的流动相：–有机溶剂如甲醇、乙腈，水–应用添加剂，成为离子对、离子抑制方法•常用固定相：–碳十八、碳八、胺基等基团–反相色谱固定相多为键合相1固定相阳离子：－SO3H(强)－CO2H(弱)阴离子：－N+R3(强)－NH2(弱)基质合成树脂纤维素硅胶离子交换剂阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；三离子交换色谱法2流动相水相缓冲液+有机改性剂调节选择性的主要参数盐种类及浓度pH值阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液；各种阴离子在阴离子交换剂上的滞留次序：FOHCOOCHHCOOClSCNBrCrONOIOCSO324324224柠檬酸离子*用柠檬酸离子洗脱比用氟离子洗脱快阳离子交换树脂阳离子交换阴离子交换++RSO3-H+H+RSO3-M+M+RNR3+Cl-+X-RNR3++X-Cl-3.分离原理阴离子交换4应用离子及可离解的化合物如：氨基酸、核酸、蛋白质等离子交换树脂的分离机理离子交换色谱概述•适用于离子型化合物的分离•分离基于离子的带电特性•洗脱次序受多种因素的影响–填料（离子交换树脂）的种类∶阴/阳，强/弱，交换基团–样品分子特性–盐的种类、浓度–温度及pH值–有机溶剂四、离子色谱（ionchromatography）离子色谱是在20世纪70年代中期发展起来的一中技术，其与离子交换色谱的区别是其采用了特制的、具有极低交换容量的离子交换树脂作为柱填料，并采用淋洗液抑制技术和电导检测器，是测定混合阴离子的有效方法。图片二、离子色谱仪器淋洗液泵色谱柱检测器泵液分离检测记录F-NO3-SO42-Cl-NO2-Br-HPO42-进样阀抑制器检测池进样离子色谱基本原理离子色谱中发生的基本过程就是离子交换，因此，离子色谱本质上就是离子交换色谱。在离子色谱的基本组成中，重要的和与其他高效液相色谱不同的就是抑制器和电导检测器。抑制器的作用废液BackGround：Na2CO3/NaHCO3(700μS)NaF,NaCl,NaNO3Na2HPO4,Na2SO4～～RetentiontimeConductivityNaFNaClNaNO3Na2HPO4Na2SO4BackGround：Na2CO3/NaHCO3(700μS)～～RetentiontimeConductivityHFHClHNO3H3PO4H2SO4RetentiontimeBackGround：H2CO3(15μS)Conductivity阴离子抑制器抑制器的作用淋洗液(Na2CO3)分析柱HF,HCI,H2SO4inH2CO3NaF,NaCl,Na2SO4inNa2CO3废液H2O不经过抑制对离子S时间S时间经过抑制废液H2OH+Na+12943样品F,CI,SO42---FSO42CI---FSO42CI---负极正极OH-自动连续再生阴离子抑制器中电化学反应和离子移动NaOH,H2H+废液废液阳极检测器H++O2H2+OH-H2OH2ONa+H++OH-H2OH+,X-H+,X-inH2OH2OH2OH2O,O2阳离子交换膜Na+,X-在NaOH淋洗液中阴极五、离子对色谱（ionpairchromatography）原理：将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子（对离子或反离子）加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏水性离子对化合物，使其能够在两相之间进行分配；阴离子分离：常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子；阳离子分离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子；反相离子对色谱：非极性的疏水固定相(C-18柱)，含有对离子Y+的甲醇-水或乙腈-水作为流动相，试样离子X-进入流动相后，生成疏水性离子对Y+X-后；在两相间分配。六尺寸排阻(凝胶)色谱法排阻色谱分离示意图相对分子质量差别大于10％的化合物才可以分离1分离原理体积排除色谱的分离机理2固定相是一种经过交联而具有立体网状结构的多聚体，其中含有大量液体（一般是水），柔软而富于弹性。凝胶3流动相不采用改变流动相组成的方法控制分离度凝胶色谱概述•分离基于分子在溶液中的体积大小•洗脱次序：大分子先被洗脱•流动相不参与分离，只起溶剂作用•分离效率低•色谱行为容易预测分离方法的选择七、亲和色谱(AC)（Affinitychromatograph）原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离。先在载体表面键合上一种具有一般反应性能的所谓间隔臂(环氧、联胺等)，再连接上配基(酶、抗原等)，这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改变淋洗液后洗脱。第三节液相色谱的固定相与流动相一、液相色谱固定相1.液-液分配及离子对分离固定相（1）全多孔型担体由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采用100μm的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见；现采用10μm以下的小颗粒，化学键合制备柱填料；（2）表面多孔型担体•（薄壳型微珠担体）30～40μm的玻璃微球，表面附着一层厚度为1～2μm的多孔硅胶。•表面积小，柱容量底；二.化学键合相色谱采用化学键合相的液相色谱1）传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快；2）寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；3）耐水、耐光、耐有机溶剂，稳