高效液相色谱法(1)

高效液相色谱法第一节概述一、起源俄国科学家：M.S.Tswett1903年发明，1906年正式命名色谱法。20世纪30年代开始广泛研究和应用色谱按流动相的物态分:气相色谱和液相色谱色谱法的简称(又叫色层法,层析法),其本质是一种分离分析方法常见的分离方法蒸馏离心电泳过滤色谱：目前最有效的分离方法以高压液体为流动相的液相色谱分析法称高效液相色谱法（HPLC)。色谱泵进样器检测器数据处理色谱柱HPLC是在经典色谱理论的基础上，采用了高压泵、高灵敏检测器等新实验技术建立的一种液相色谱分析法。它是20世纪70年代初发展起来的一种新的色谱分离分析技术。液相色谱的分类1.按流动相和固定相的相对极性分:正相色谱：固定相的极性大于流动相反相色谱：固定相的极性小于流动相2.按分离过程的机理分:吸附色谱分配色谱离子交换色谱,简称离子色谱(IC)体积排除色谱超高效液相色谱（UPLC）：是区别于HPLC的液相色谱新领域基于小颗粒填料和LC原理的一种创新方法实现超高分离度、灵敏度、分析速度与传统的HPLC相比，UPLC的速度、灵敏度及分离度分别是HPLC的9倍、3倍及1.7倍。是Waters公司对液相色谱的新贡献(2004年3月正式推出)二、HPLC与GC区别相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测主要差别：分析对象、流动相、操作条件上分析对象GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品，高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品不可检测，占有机物的20%HPLC：适于分析气相色谱法不能分析的分子量较大、难气化、不易挥发或对热敏感的物质、离子型化合物及高聚物的分离分析，大约占有机物的70～80%。流动相差别GC：流动相为惰性气体，组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用HPLC：流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用力，对分离起很大作用操作条件差别GC：一般都在较高的温度下进行分离分析HPLC：通常在室温条件下操作；高压（15-35Mpa。）。三、HPLC与经典LC区别相同：高效液相色谱的原理与经典液相色谱相同主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段。固定相差别经典LC：固定相粒径100μm且不均匀；HPLC：固定相粒径10μm（球形，匀浆装柱）输液设备经典LC：常压输送流动相，柱效低（H↑，n↓），分析周期长；HPLC：高压输送流动相；柱效高（H↓，n↑）；分析时间大大缩短检测手段经典LC：无法在线检测HPLC：可以在线检测四、HPLC的特点和应用1．高柱效2．高灵敏度3．高选择性4．分析速度快5．应用范围广泛五、HPLC的固定相和流动相简介（一）、固定相以承受高压能力来分两大类刚性固体：以二氧化硅（硅胶）为基质，可承受7.0108～1.0109Pa的高压，它是目前最广泛使用的一种固定相。硬胶：主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为3.5108Pa。（二）、流动相1.分类按组成不同可分为单组分和多组分按极性可分为极性、弱极性、非极性按使用方式有固定组成（等梯度）淋洗和梯度淋洗。2.常用溶剂己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、甲醇、水。常用流动相极性石油醚＜汽油＜庚烷＜己烷＜二硫化碳＜二甲苯＜甲苯＜氯丙烷＜苯＜溴乙烷＜溴化苯＜二氯乙烷＜三氯甲烷＜异丙醚＜硝基甲烷＜乙酸丁酯＜乙醚＜乙酸乙酯＜正戊烷＜正丁醇＜苯酚＜甲乙醇＜叔丁醇＜四氢呋喃(THF)＜二氧六环＜丙酮＜乙醇＜乙腈＜异丙醇＜甲醇＜氮氮二甲基甲酰胺＜水第二节高效液相色谱仪高效液相色谱仪自1967年问世以来，基本结构和工作流程都差不多。典型的高效液相色谱仪是由五个基本部分和相关辅助部件构成。高压输液系统进样系统分离系统检测系统色谱数据处理系统（色谱工作站）一、高压输液系统（一）贮液罐现多数使用溶剂瓶，一般采用耐腐蚀的玻璃瓶或聚四氟乙烯瓶，容量为1到2L。贮液罐的放置位置要高于泵体。（二）高压输液泵气相色谱由高压钢瓶直接提供动力，高压输液泵是高效液相色谱仪中关键部件之一。高压输液泵的类型高压输液泵主要有恒压泵和恒流泵两类，常使用恒流泵。恒流泵有几种类型，其中往复柱塞泵目前应用较多。（三）输液系统的辅助装置1．过滤器：除掉机械杂质及固体颗粒。一般用0.45或0.2μm微孔滤膜（分有机相和水相滤膜）进行过滤。2．混合器：体积不宜大。3．脉动阻尼器：种类多，都有一定容积和弹性。4．压力测量装置：电子压力控制器流量5．流量测量装置：电子流量计6．脱气装置：除掉溶于流动相中的各类气体，以保证柱效能。吹氦脱气法。这种脱气方法虽然好，但氦气价格较高，很少使用。加热回流法。此法的脱气效果较好。在操作时要注意冷凝塔的冷却效率，否则溶剂会丢失，混合流动相的比例会有变化。抽真空脱气法。此法可使用真空泵，降压至0.05～0.07MPa，即可除去溶解的气体。但是由于真空脱气会使混合溶剂组成发生变化，从而影响到实验的重现性，因此多用于单溶剂体系的简单分析。超声波脱气法。将欲脱气的流动相置于超声波清洗机中，用超声波震荡10～20min。此法的脱气效果最差。在线脱气法HPLC仪器可配在线脱气机。在线脱气使用简单，低故障，有效。（四）梯度洗脱装置梯度洗脱的目的：提高分离效果，缩短分析时间。适用于分析极性差别较大的复杂组分类似GC的程序升温（沸程较长样品）梯度洗脱装置分为两类：1．外梯度装置（又称低压梯度），流动相在常温常压下混合，用高压泵压至柱系统，仅需一台泵即可。2．内梯度装置（又称高压梯度），先将两种溶剂分别用泵增压后，再由泵按程序压入混合室，混合，再注入色谱柱。二、进样系统进样系统包括进样口、注射器和进样阀等。HPLC进样方式可分为：隔膜进样、停流进样、阀进样、自动进样。（一）阀进样—六通阀进样一般高效液相色谱手动进样通常使用耐高压的六通阀进样装置。六通阀的进样方式有部分装液法和完全装液法两种。完全装液法进样量准确，重复性好（0.5%）①用部分装液法进样时，进样量应不大于定量环体积的50%（最多75％）。②用完全装液法进样时，进样量应不小于定量环体积的5~10倍（最少3倍。（二）自动进样用于大量样品的常规分析。三、分离系统分离系统包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。(一)色谱柱色谱柱是液相色谱的心脏部件,多为直形。色谱柱可分为分析柱；制备柱；分析柱的保护柱。1．柱材料及规格包括柱管与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属。玻璃管耐压有限，故金属管用得较多，它是由内部抛光的不锈钢管制成。一般色谱柱长5～40cm，内径为1～6mm。凝胶色谱柱内径3～12mm。制备柱内径较大，可达25mm以上。2．保护柱一般在分离柱前有一个前置柱，前置柱内填充物和分离柱一样，安装在分析柱前。其作用是收集、阻断来自进样器的机械和化学杂质，以保护和延长分析柱的使用寿命。选择保护柱的原则是在满足分离要求的前提下，尽可能选择对分离样品保留低的短保护柱。一般用1cm长的保护柱即可保护柱也可装填和分析柱不同的填料，如较粗颗粒的硅胶（10～15μm）。保护柱为消耗品，通常分析50～100次样品，柱压力呈增大趋向时就需要更换。目前市场上供应可更换芯式设计保护柱，是由保护套和可更换式保护芯两部分组成。(二)柱连接柱出、入口的连接管的死体积越小越好一般常用窄孔(内径0.13mm)的厚壁(1.5～2.0mm)不锈钢管，以减少柱外死体积.(三)柱温控制在高效液相色谱分析中，柱温一般为室温或接近室温。可以采用带有恒温加热系统的金属夹套来保持色谱柱的温度。温度可以在室温到60℃之间调节。对凝胶渗透色谱仪，其柱温可从室温至150℃实现精确控制。四、检测系统检测器实际上是一种换能装置，它将流动相中组分含量的变化，转变成可测量的电信号(通常是电压)，然后输入色谱工作站。高效液相色谱的检测器很多，光学(紫外，荧光，折光检测器)；电化学(极谱、电导、库仑、离子选择电极)等。对于毛细管气相色谱和高效液相色谱，检测器的色谱峰展宽是柱外效应的一个主要来源。HPLC用得最多的是UV检测器。甲醇，水可用作UV检测器的流动相。(一)检测器分类1．按性质或应用范围分类有总体性能检测器和溶质性能检测器。总体性能检测器：示差折光、电导等检测器，GC中的热导检测器也属于这类检测器。溶质性能检测器：紫外检测器、荧光检测器、化学发光检测器、安培检测器、手性检测器等。2．按测量信号性质分类有浓度型检测器和质量型检测器。浓度型检测器：大部分液相色谱检测器属这一类检测器。质量型检测器：库仑检测器。（二）、常用检测器1、紫外－可见光检测器（UV/VISdetector）：（UVD）又称紫外检测器。约有80％的样品可以使用这种检测器，是HPLC中应用最广泛的检测器。适于吸收紫外-可见光的物质。（1）、工作原理与结构紫外检测器由光源、流通池和记录器组成。工作原理是进入检测器的组分对特定波长的紫外光能产生选择性吸收，其吸收度与浓度的关系符合光吸收定律。紫外检测器的光学系统（2）、UV检测器分类：1）固定波长紫外吸收检测器：低压汞灯提供固定254nm或280nm。2）可变波长检测器（VWD）：氘灯/卤钨灯做光源，光栅分光3）光二极管阵列检测器（PDAD，PDA，DAD）：1982年惠普公司推出世界上首台光电二极管阵列检测器PDAD有1024个二极管阵列，可以得到吸光度、波长、时间——这样的三维光谱（3）、常用溶剂的紫外截止波长溶剂正已烷二硫化碳四氯化碳苯氯仿二氯甲烷四氢呋喃丙酮乙腈甲醇水截止波长/nm190380265210245233212330190205187（4）、UVD的特点:1）灵敏度高1×10-8g/mL（萘的甲醇溶液）。2）噪声低≤±1.0×10-4AU3）线性范围宽106（1uv为最小单位）4）应用广泛5）属溶质性能检测器，适用于梯度洗脱。6）属浓度敏感型检测器7）属非破坏性检测器，可要用于制备色谱，也能与其它检测器串联使用。8）结构简单，维修方便。2、示差折光检测器：也称为折光指数检测器（refractiveindexdetectorRID）：示差折光检测器是除紫外检测器之外应用最多的检测器。（1）工作原理与结构RID是通过连续测定色谱柱流出液折光率的变化来检测样品浓度的。就是检测参比池（流动相本身）和样品池中流动相之间的折光率差值，差值与浓度呈正比。（2）特点1）属总体性能检测器，是通用型检测器。它对没有紫外吸收的物质，如高分子化合物、糖类、脂肪烷烃等都能检测；示差折光检测器不能用于梯度洗脱2）适用于流动相紫外吸收本底大，不适合用紫外检测器的体系；在凝胶色谱中示差折光检测器是必不可少的，尤其是对聚合物，如聚乙烯、聚乙二醇、丁苯橡胶等的分子量分布的测定；3）属浓度敏感型检测器；4）缺点是灵敏度低：最小检测浓度达10-6～10-7g/mL；5）线性范围小于105；6）对压力和温度变化敏感。7）最常用的溶剂是水常采用空气饱和溶剂作流动相另外要将检测器的流动相出口位置提高。五、色谱数据处理系统-色谱工作站工作站自动定性和定量分析1.定性分析微处理机在定量计算时，一般通过保留值来识别峰。具体采用下述两种方法定性：“时间窗”法、“时间带”法（1）“时间窗”法：tR±Δt这是一种绝对保留时间法，鉴别位于预定保留时间绝对容限内的峰。每个峰的保留值相同，设置简单，但用于识别保留时间相差很近的相邻峰不大方便。（2）“时间带”法：tR(1±a%)这是一种相对保留时间法，鉴别位于预定保留时间相对容限内的峰。对每个峰单独设置，设置较麻烦，但对识别相邻峰的分辨率较好2、定量分析（1)定量分析方法所有色谱数据处理机均支持面积归一、校正面积归一（这个通常就是理论上的归一化法，校正系数是相对校正因子或相对校正因子倒数称为响应值）、带范围因子的校正面积归一、外标法、内标法等定量计算方法。（2）ID表建立合适的ID表（选择合适的MODE）对准确定量很重要。选择内容是：用峰面积还是用峰高定量方法；峰的识别用“时间窗”法还是“时间带”法；校正方法用“单点”法还是“双点”法。ID表内容还包括：峰的保留时间；