搜索
miRNA介导基因沉默的基本机制6U2c2w7L$G4L5L,W6jAnaEulalio,EricHuntzingerandElisaIzaurraldeCell132,9–14,January11,2008$y#l#aT,?1b2T3R!j/mp6S$L微RNA是长度为22核苷的RNA，通过与标靶mRNA3’非翻译区结合，使转录后的基因表达沉默。尽管对微RNA的生物合成和功能已有较多的了解，但在动物细胞中miRNA使基因表达沉默的机制尚无定论。我们在本文讨论miRNA介导的基因沉默的各种模型，并阐述能消弥模型差异的假说。*M$T4v&J+|8g2~2r3F微RNA（miRNA）在发育、细胞分化、增殖和凋亡等许多生物学过程中起重要作用。最近的证据表明miRNA也与癌症和代谢异常等人类疾病有关。在非脊椎动物中至少鉴定了100个miRNA基因，在脊椎动物和植物中已鉴定了500–1000个miRNA基因。根据对miRNA标靶的计算机预测，估计每个miRNA调节几百个不同的mRNA，因此相当大一部分转录体可接受miRNA的调节。'X5e8R(E+i-G4Z!K5e'\miRNA为了执行调节功能，与Argonaute家族结合形成由miRNA诱导的沉默复合物(miRISC)。在这些复合物中，miRNA指导Argonaute蛋白进入完全或部分互补的mRNA标靶，使这些mRNA保持转录后沉默。4]s-c9k*@((},dE4x0e!}8]*尽管我们对miRNA生物合成和功能的理解正在不断加深，但对miRNA用以调节基因表达的机制仍无定论。已发表的研究表明，miRNA以4种不同的方式抑制蛋白质表达：（1）与翻译偶联的蛋白质降解；（2）翻译延长的抑制；（3）翻译提前终止（核糖体脱落）；（4）翻译起始的抑制。另外，尽管有不完全的mRNA—miRNA碱基配对，动物miRNA能够诱导mRNA标靶大量降解。微RNA还可以在称为mRNA加工体或P体（不存在翻译机制）的独立细胞质位点，通过螯合mRNA使其沉默。我们在本文中讨论这些不同的miRNA抑制机制的证据以及这些机制的差异。翻译起始后的抑制机制早期在线虫中的研究以及最近在哺乳动物细胞培养物中的研究提供了miRNA在翻译起始后抑制蛋白质合成的有利证据。尽管这些研究的细节有所不同，但其结论都来自一个共同的观察，即miRNA及其标靶在蔗糖沉降梯度中与多聚核糖体结合在一起。因为这些多聚核糖体对各种抑制翻译的条件敏感，说明它们有翻译mRNA标靶的活性。例如，这些多聚核糖体与多羟基瑙醇、嘌呤霉素或密旋霉素等翻译抑制剂短暂保温后，可分离成核糖体单体或核糖体亚基。+W,I-g6q0T_)D.X:Z#|E6\'P'U/ZmiRNA的标靶明显可被有效翻译，但却检测不到相应的蛋白质产物，人们从这种自相矛盾的观察中提出了新生多肽链可能在翻译的同时被降解的假说。然而，这种假说是建立在负结果，而不是建立在直接的正面证据上。例如，假定的蛋白酶的性质尚不清楚。蛋白酶体参与的可能性已被排除，因为蛋白酶体抑制剂无法恢复沉默的报告mRNA的蛋白质表达。为了研究miRNA如何使标靶沉默，Petersen等设计了一个含有3’非翻译区(3’UTR)的合成的miRNA报告mRNA，其3’UTR带有6个与转染siRNA（miRNA类似物）部分互补的相同位点。当这个报告mRNA瞬时表达时，它与多聚核糖体结合，尽管siRNA抑制它的表达。但是如果翻译起始受到抑制，这些核糖体GeneratedbyFoxitPDFCreator©FoxitSoftware的解离要比与对照（无抑制）mRNA结合的核糖体的解离更快。由此产生了miRNA引发核糖体提前解离或核糖体脱落的假说。6G6y!Z;V/s8x(V.{miRNA介导翻译起始后的抑制还有另外的证据：即使是通过含有一个内部核糖体进入位点(IRES)的5’UTR启动的报告mRNA的翻译，也会发生沉默。因为IRES启动的mRNA的翻译与与mRNA帽结构无关，所以这些结果表明miRNA是在帽识别之后的阶段抑制翻译。.E:{$`2Ks!{翻译起始的抑制8i4H1GN5b*C/x与上述研究不同，Pillai等展示了miRNA及其标靶在蔗糖梯度中不与多聚核糖体结合，而是与哺乳动物细胞中的自由mRNP结合，这说明翻译抑制发生在起始阶段。另外，在上述以及在其他研究中，通过不依赖帽的机制（即通过IRES）进行翻译的mRNA很难再被miRNA所抑制，这进一步支持miRNA抑制依赖于帽的翻译起始的论点。1|+k-N,M2d%Y与miRNA在阻断翻译起始中起作用相吻合的是，Kiriakidou等报道了一个出人意料的观察：Argonaute蛋白的中心结构域与细胞质帽结构蛋白eIF4E（真核翻译起始因子4E）有序列相似性，eIF4E是依赖于帽的翻译起始所必需的。eIF4E通过在处于两个色氨酸之间的帽的甲基化碱基上的堆积，与mRNA的m7Gppp-帽结构结合。在与eIF4E的色氨酸相对应的位置上，Argonaute蛋白有可介导类似相互作用的苯丙氨酸。类似的发现还有Kiriakidou展示的人Argonaute2(AGO2)与葡聚糖凝胶珠上的m7GTP的结合，甲基化帽类似物（如m7GpppG）可与这种结合形式竞争，而非甲基化m7GpppG不能形成竞争。这些研究人员进一步展示了用缬氨酸置换一个或两个AGO2苯丙氨酸可消除基因沉默活性。这些结果支持miRNA通过从帽结构中置换eIF4E，在帽识别步骤抑制翻译。1q)L'Z)B!W)AE4S#@8OChendrimada等报道的证据也说明miRNA抑制一个早期翻译步骤（在延长步骤之前）。他们用人细胞展示了AGO2可与eIF6以及核糖体大亚基结合。eIF6通过与核糖体大亚基结合，防止大亚基过早地与核糖体小亚基连接。如果AGO2使eIF6与之结合，核糖体的大亚基和小亚基则可能无法结合，导致翻译受到抑制。)t'P/g*?!k2Il1@0D;c5j0B9[8w!f尽管Kiriakidou和Chendrimada都提供了miRNA在翻译延长步骤之前抑制翻译的研究结果，但他们提出了相互排斥的基本机制。我们必须更全面地研究eIF6和Argonaute的帽结合结构域怎样在mRNA沉默中起作用。特别是在没有关于真核Argonaute蛋白结构信息的情况下，对Kiriakidou的研究结果的另一种可能的解释是，苯丙氨酸的突变可通过一种不同的机制影响该蛋白质的活性。而eIF6是核糖体60S亚基生物合成所必需的，它的缺失可能有我们不完全了解的其他影响。u&B)Q!s'X%r8r/ZmiRNA介导的mRNA降解最初的研究曾报道动物miRNA抑制翻译，对标靶mRNA的丰度没有多大影响。然而最近的研究报告表明动物miRNA确实导致标靶大量降解。这方面的证据包括，在miRNA途径受到抑制（如去除Dicer或Argonaute蛋白）的细胞中，预期的有功能的miRNA标靶的水平增加。相反，如果特定miRNA异常表达，含有这些miRNA结合位点的转录产物的丰度就会减少。同样，有几个例子说明特定miRNA的表达与含有互补结合位点的转录产物的减少有相关性。例如，在斑马鱼胚胎的配子转录启动时，miR-430表达的大量增加伴随有在3’UTR含miRNA位点的母系mRNA的大量降解。!f,X-?&s7i#Y;g7@5B)R(|,X在动物细胞中，miRNA不是通过Argonaute蛋白的内切核苷水解切割降解mRNA，而是将mRNA送到普GeneratedbyFoxitPDFCreator©FoxitSoftware降解机制中（除非miRNA与标靶完全互补）。在斑马鱼胚胎、线虫、果蝇和人细胞中对miRNA加速其标靶的脱腺苷化和脱帽的研究支持上述观察。$K:h)X6xf9TJ4ymiRNA介导的信使RNA降解需要Argonaute蛋白、P体组分GW182、CAF1-CCR4-NOT脱腺苷酶复合物、脱帽酶DCP2和几种脱帽活化因子（包括DCP1,EDC3和RCK/p54）。目前的证据表明GW182通过直接作用于Argonaute蛋白而与miRNA标靶聚集，从而在翻译抑制中起作用。GW182也是通过脱腺苷化和脱帽降解的转录产物标靶的标记。(a4T(X4d#~*H2?6E尽管有重要证据显示miRNA启动标靶的降解，但仍有一个悬而未决的重要问题：标靶降解是一个造成沉默的独立机制还是由于影响翻译而造成标靶降解？某些证据表明miRNA介导的mRNA降解不与翻译偶联。在人细胞中，可通过在miRNA标靶的5’UTR插入一个强力茎环结构抑制标靶的翻译，但这种标靶仍然以依赖于miRNA的方式脱腺苷。同样，在斑马鱼胚胎和人细胞抽提物中，尽管miRNA标靶有可破坏翻译的缺损的帽结构(Appp-帽)，但它们仍可脱腺苷。此外，在果蝇细胞和人细胞抽提物中，在不进行翻译时亦可发生miRNA介导的mRNA降解。w!e#~.V5{'b降解的程度明显是由mRNA标靶而不是由miRNA决定，这是因为相同的的miRNA可以标靶专一性方式抑制翻译或诱导mRNA降解。Aleman等发现miRNA是进行降解还是进行翻译抑制取决于miRNA-mRNA二聚体的结构（即误配的数量、类型和位置）。Grimson等发现miRNA结合位点的数量、位点之间的距离以及在3’UTR中的位置和RNA的环境都强烈影响调节的程度，尽管在每种情况中翻译抑制和降解的相对作用尚不清楚。因此，miRNA是否进行mRNA降解主要取决于miRNA结合位点和RNA环境的特定性质，最可能的决定因素是miRNA与特定标靶结合蛋白的特殊相互作用。9[1~1t0|4B;j在P体的螯合&J$I)O8J0D6[9`0w2lArgonaute蛋白、miRNA和miRNA标靶共处于一个称为P体的细胞质位点。P体的其他组分，如GW182、CAF-CCR4-NOT脱腺苷酶复合物、脱帽酶DCP2、脱帽激活因子（如DCP-1、EDC3、Ge-1）和RNA解旋酶RCK/p54等都参与miRNA功能。Argonaute蛋白、miRNA和miRNA标靶在P体的测定产生了一个miRNA标靶在P体中螯合的模型，即miRNA标靶与翻译隔绝并可能被降解。人们对miRNA定位于P体是mRNA沉默的原因还是结果仍无定论。然而，最近的研究证实，在缺少可探测到的微小P体的细胞中，miRNA途径并不受影响。因此尽管P体组分在miRNA介导的基因沉默中起重要作用，但miRNA的功能并不需要这些组分聚集成为微型P体。这些结果说明基因沉默是在可溶性细胞质部分开始的，但是沉默机制在P体的定位并不是沉默的原因，而是它的结果。3q'Y3C.@;D;Z体外研究的结果+d3\)wH*Z(P,t1x2P$d%J5_miRNA对翻译起始的抑制已在各种来源的无细胞抽提物的体外研究中得到重复，包括兔网织红细胞裂解物、果蝇胚胎抽提物以及两种哺乳动物细胞系（小鼠Krebs-2腹水和人HEK293F细胞）的抽提物。miRNA可在上述抽提物中使有m7Gppp帽的mRNA的翻译沉默，但不能使有合成的Appp帽结构（与polyA尾无关）的转录产物的翻译沉默。在小鼠和人细胞抽提物中，以依赖于IRES方式启动翻译的转录产物很难被miRNA调节。&]-X0D)~k对poly(A)尾在沉默中的作用研究的很少，在正式研究这个问题时，无多聚腺苷化的mRNA或者在体内GeneratedbyFoxitPDFCreator©FoxitSoftware沉默，或者在体内和体外都不沉默或部分沉默，与帽结构无关。*~0c2a%I6q3u:D(fWakiyama等观察到了mRNA沉默确实需要帽结构和poly(A)尾。他们的细胞抽提物还重复了早先在斑马鱼