micro-RNA

RNA一度被认为仅仅是DNA和蛋白质之间的“过渡”，但越来越多的证据清楚的表明，RNA在生命的进程中扮演的角色远比我们早前设想的更为重要。RNA干扰（RNAinterference）的发现使得人们对RNA调控基因表达的功能有了全新的认识，在2002年度Science评选的10大科学成就中RNAi名列榜首。随着对小分子RNA研究的不断深入，人们发现有一部分RNA分子通过激活或抑制基因转录控制基因的表达,在基因组信息转化为分子效应和生物效应过程中发挥着重要的作用。这种新发现的分子即是我们即将介绍的microRNA(miRNA)。microRNA是近年来在多种真核细胞及病毒中发现的一类来源于内源性染色体上的非编码单链RNA。本文依据目前microRNA的研究进展，分别概括了microRNA的发现、合成、特征、功能和应用等方面的内容，应用方面重点介绍了在糖尿病足等慢性创面及瘢痕上取得的一些成果。最后得出的结论是，microRNA调控着各种生物学过程，在上述疾病的发生上有重要的研究意义，虽然目前研究不甚深入，很多问题有待探索，但可以想象，microRNA的研究将会有深远的影响。关键词：非编码RNA；microRNA；研究进展；糖尿病足；慢性创面；瘢痕引言分子生物学的中心法则是基因组DNA通过转录产生信使RNA（mRNA），信使RNA翻译成蛋白质。然而这个法则却因为microRNA及RNAi的发现而受到了挑战，因为一部分DNA转录生成的mRNA前体（pre-mRNA）并非翻译成为蛋白质；相反，这些RNA调节其他基因的表达。microRNA(miRNA)是近年来在多种真核细胞及病毒中发现的一类来源于内源性染色体上的非编码单链RNA,长度约为22（18～25）个核苷酸（nt）的短序列,在进化上具有高度的保守性。它们基于与靶mRNA的序列互补，能够通过与靶mRNA特异性的碱基互补配对从而抑制其翻译。与siRNA不同的是microRNA一般不诱导mRNA的降解，而是以一种未知的方式诱发蛋白质翻译抑制，从而对基因进行转录后的表达调控。microRNA在各种生物体中的广泛发现及其在调控基因表达中所发挥的重要生物学作用的逐步确证，使非编码RNA在生命中的重要作用得到了认可。microRNA和siRNA研究的重大进展为RNA研究带来了新的转折和契机，同时为更全面地认识生物大分子——RNA，而不仅是蛋白质和DNA——在生命活动中的重要作用起到了巨大的推动作用。1microRNA的发现VictorAmbros的实验室于1993年在秀丽隐感线虫中首次发现了microRNA。与此同时[1]，GaryRuvkun的实验室鉴定了首个microRNA的靶标基因[1]。这两个重要的发现共同确认了一种新的转录后基因调节机制。直到大约七年后，当Ruvkun和Horvitz的实验室在线虫中鉴定出第二个microRNA[2]以及人们对另一类短链RNA——siRNA（参与植物和动物体的RNA干扰过程和相关现象）开始感兴趣的时候，才意识到microRNA的重要性。在microRNA发现后，不到2年的时间里，许多实验室相继发现了更多的microRNA，其家族成员迅速扩充到将近300个，对miRNA的研究力度也不断加大。研究发现部分miRNAs参与生命过程中一系列的重要进程，包括早期发育(Reinhart2000)，细胞增殖，细胞凋亡，细胞死亡(Brennecke2003），脂肪代谢（Xu2003)和细胞分化(Kawasaki2003)，揭示了miRNA与心血管疾病、癌症、糖尿病等众多疾病有着密切的关系。2microRNA的生物合成microRNA基因是以单个基因或基因簇的形式离散地分布于基因组上，它们中大多数位于基因间隔区，但也有相当数量的microRNA位于转录单元内含子或外显子上。大多数microRNA基因在RNA聚合酶Ⅱ的作用下合成初始microRNA转录物（pri-miRNA），很少一部分则由RNA聚合酶Ⅲ转录。pri-miRNA具有一段并不完全互补的双链RNA区域，和一个大的发夹结构。在动物体内，pri-miRNA转化为成熟的microRNA经历了2次连续的剪切。在细胞核内pri-miRNA经Drosha酶（一种RNaseⅢ酶）剪切，形成约70nt的茎环结构，即pre-miRNA。随后，pre-miRNA由转运蛋白Exportin-5(Exp-5)运输至细胞质中，在Dicer酶的作用下剪切产生一个长为21~24的microRNA单链结构，形成成熟microRNA。成熟microRNA随即结合到RNA诱导的沉默复合体中，介导转录后基因表达沉默，抑制基因表达（合成过程简图如下）。DNA→priRNA→preRNA（经过Drosha酶剪切）→miRNA(经过Dicer酶切割）3生物学特征microRNA广泛地存在于多种真核生物中，从低等生物到人类都有其存在的痕迹。其生物学特性主要表现为：高度保守性，时序表达特异性和组织表达特异性。3.1高度保守性microRNA的序列结构在各个物种间具有高度的进化保守性，最具有microRNA保守性的是let-7，它广泛存在于两侧对称的生物体中，其序列保守性令人吃惊。科研人员认为，microRNA的保守性具有重要的生物学意义，提示在不同生物发育过程中，microRNA具有相同的调控机制，同时也为生物早期进化同源性提供了某种依据。3.2时序表达特异性在不同组织、不同发育阶段中，microRNA的表达水平有显著差异。一些microRNA呈时间发育特异性表达.NeilsonJR[3]等研究表明在细胞发育的不同阶段mRNA表达是动态调控的。AsonB[4]等研究发现，不同物种间许多microRNA表现高度保守性，mRNA表达变化越大，生理差别越大。物种间的差别最主要是由于microRNA表达的异时性变化和较小程度的空间表达差异。由此，可以推测microRNA表达的变化可能是动物发育过程中形成生理差别的原因。3.3组织表达特异性一些microRNA表达具有细胞和组织特异性，如miR-17～20位于Hela细胞同一基因簇内，并在斑马鱼细胞中表达，但在鼠肾和蛙卵巢细胞中未检测到。这种特异性对microRNA的调控功能有重要意义。4生物学功能MicroRNAs(miRNAs)是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体，经过Dicer酶加工后生成。在生物的整个发育过程中microRNA可能有调节细胞早期发育,参与细胞分化和组织发育等生物功能,其主要的作用是调控基因表达[1]。这些非编码小分子RNA（miRNAs）参与调控基因表达的机制不同于siRNA（双链），但是和siRNA密切相关。目前认为，MicroRNAs通过两种机制调节靶基因的表达:(1)结合到靶mRNA3′端非翻译区(3′UTRs),抑制其翻译(2)像siRNA作用一样，结合到靶上并降解靶mRNA[1]。4.1调节细胞早期的发育在植物miRNAs的研究中发现miRNAs可能参与植物的发育过程。在carpelfactory(car)突变株中3个miRNAs的表达水平显著下降。CARPELFACTORY是一个类似Dicer的酶，参与植物的发育，其缺失突变株表现为胚胎和叶片发育的缺陷。实验结果提示这种缺陷是由于缺少miRNAs加工而造成的。由此可以推测miRNA参与调节细胞早期的发育[5]。多数的植物miRNAs在某些特定组织中高水平表达也提示他们可能参与了植物组织的发育[5]。4.2参与细胞分化和组织发育一些编码microRNA基因，例如：lin24、let27、mir214、mir223和bantam已被证实在细胞分化和组织发育中起重要作用，其他的microRNA由于具有特异性时空表达的特点，被认为具有相似的重要性[2]。Chen等[10]首次阐述了哺乳动物中microRNA的功能：利用逆转录病毒作载体使mir2181在鼠科动物的造血祖细胞中异常的表达,然后用不同的条件处理这些细胞,分析B淋巴细胞和T淋巴细胞，发现B淋巴细胞量加倍，而T淋巴细胞不受影响。显示microRNA可能在鼠类和人的细胞发育分化中起着关键作用。最新研究发现microRNA可能在神经系统也发挥着重要的作用。microRNA及其他小RNA在神经系统中广泛存在，并且其中一些是大脑中所特有的。它们可以调节神经细胞的生长发育和神经干细胞向神经细胞的转化，并且与精神分裂症、帕金森综合征和其他神经异常的发生有关[4]。在肌肉发育方面，Clop等[10]。证实，Texel绵羊中的GDF8基因的3′UTR内的一个点突变产生了一个可以在骨骼肌内高度表达的两个microRNA，即miR21和miR2206,它们同时作用靶位点,从而引起microRNA介导的myostatin浓度在转录后降低而造成肌肉肥大；Chen等[10]。证实，miR21通过作用于HDAC4而促进成肌细胞分化为成熟的肌肉细胞,抑制细胞扩增，miR2133则通过抑制SRF而促进成肌细胞扩增,抑制其分化。4.3调控基因表达在各类小分子RNA中，microRNA具有最广泛的基因调节功能。实验表明引入和let-7目的mRNA靶完全互补的miRNA会诱导mRNA靶的降解。还有实验结果表明一些miRNA，包括在植物中发现的ScarecrowmiRNA，能结合完全互补的mRNA链从而降解mRNA序列，抑制蛋白合成。这提示miRNAs具有和siRNAs一样的作用，这两种小分子RNA作用通路可能有重叠的部分。内源性人的miR221通过与靶位完全互补诱导mRNA剪切，这种特性一度被认为是siRNA的特性之一。相反，将合成siRNA通过与靶位点错配可以下调mRNA的表达。由此说明microRNA和siRNA可利用相似的机制抑制mRNA的表达,而最终选择哪几种机制也许在很大程度上完全取决于其与靶mRNA的互补程度。4.4其他生物学功能bantammiRNA是第一个被发现具有原癌基因作用的miRNA。除了lin-4、let-7，已知还有一些miRNAs可能参与在细胞分化和组织发育过程中起重要作用的基因的转录后调控，例如mir-14、mir-23等。对一部分miRNAs的研究分析提示：miRNAs参与生命过程中一系列的重要进程，包括早期发育(Reinhart2000)，细胞增殖，细胞凋亡，细胞死亡(Brennecke2003），脂肪代谢（Xu2003)和细胞分化(Kawasaki2003)。此外，一个研究表明，2个miRNAs水平的下降和慢性淋巴细胞白血病之间的显著相关，提示miRNAs和癌症之间可能有潜在的关系(Calin2002)。5microRNA在糖尿病足等慢性创面及瘢痕研究上的应用迄今已在人类基因组中注释了500多种microRNA。借助进一步发展的测序技术以及其它克隆技术，将会有更深入的研究。这将不断的增加人们对miRNA的认识，为更深入的发展疾病治疗方法及新药研制打下良好的基础。5.1在糖尿病足等慢性创面方面的研究根据美国流行病学统计结果表明慢性创面所消耗的医疗资源逐年上升，超过650万美国人平均每年总花费超过250亿美元[6]。伤口愈合是一种生理反应,在人类组织损伤后，即时反应旨在止血,从而为伤口愈合提供了基础,为炎症过程紧紧跟随。适度的炎症是有用的,是治疗的先决条件。慢性炎症导致伤口derails愈合梯级受损。表现为Dicer中断,RNaseIII酶上升，而miRNAs产生对整个免疫系统有重大影响。新近的研究表明,miRNAs,特别是miR-21,miR-146,miR-155等在慢性炎症中扮演重要角色,主导整个炎症反应的进行[6]。miRNA主导伤口炎症反应。伤口炎症反应有严格促炎信号来指导炎症的过程。这些信号之间的不平衡是导致慢性炎症和derails愈合梯级受损的主要因素。已经证实miRNA影响了几个关键调节炎症反应因子及炎症过程中,从而影响伤口愈合。国外研究表明，miRNA调节某些细胞因子和Cox-2基因的表达。从而影响AA、花生四烯酸,ARE-BP,AU-