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基因工程操作环境操作对象操作水平基本过程结果生物体外基因ＤＮＡ分子水平剪切拼接导入表达人类需要的基因产物一、基因工程DNA重组技术实质：基因重组二、基因操作的工具1、基因的剪刀——限制酶2、基因的针线——DNA连接酶3、基因的运输工具——运载体2、基因的的针线——DNA连接酶连接的部位：磷酸二酯键（在“梯子”的扶手处），不是氢键（在“梯子”的踏板处）。结果：两个相同的黏性末端的连接。思考（１）用DNA连接酶连接两个相同的黏性末端要连接几个磷酸二酯键？（２）用限制酶切一个特定基因要切断几个磷酸二酯键？２个４个３、基因的运输工具——运载体作用：具备的条件种类：将外源基因送入受体细胞。能在宿主细胞内复制并稳定地保存具有多个限制酶切点具有某些标记基因质粒、噬菌体的衍生物和动植物病毒。使用运载体的目的：用它作为运载工具，将目的基因送到宿主细胞中去。质粒上会存在某些标记基因，标记基因有什么用途？（鉴别受体细胞是否含有目的基因并筛选含目的基因的受体细胞）思考三、基因操作的基本步骤1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测和鉴定1、目的基因的获取(一)、目的基因主要是______________________编码蛋白质的结构基因（二）、获取目的基因的常用方法有哪些?（1）从基因文库中获取（2）利用PCR技术扩增（3）人工合成（1）、从基因文库中获取目的基因将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库.基因文库基因组文库部分基因文库（如:cDNA文库）基因文库:①概念：PCR全称为_______________，是一项在生物____复制___________的核酸合成技术③条件：___________、_______________、___________、___________.②原理：__________多聚酶链式反应体外特定DNA片段DNA双链复制模板DNA四种脱氧核苷酸DNA引物热稳定DNA聚合酶利用PCR扩增目的基因④过程：a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成___________b、退火（复性55℃-60℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的________。D、循环氢键单链DNA双链DNA链人工合成：——根据已知的氨基酸序列合成DNA蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测目的基因化学合成2基因表达载体的构建：它们有什么作用？a、目的基因b、启动子c、终止子d、标记基因位于基因的首端,是RNA聚合酶识别和结合位点位于基因的末端,终止转录鉴别受体细胞是否含有目的基因并筛选含目的基因的受体细胞•常用的受体细胞：有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。•将目的基因导入受体细胞的原理借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。3、将目的基因导入受体细胞（1）将目的基因导入植物细胞①农杆菌转化法②基因枪法③花粉管通道法（2）将目的基因导入动物细胞显微注射技术：将基因表达载体提纯，用显微仪注射到受精卵中（3）导入微生物细胞①原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少用Ca2+处理细胞感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子②方法：四、目的基因的检测与鉴定检测①导入检测：目的基因是否导入受体细胞DNADNA——DNA分子杂交②表达检测转录检测——分子杂交翻译检测——抗原抗体杂交分子检测法鉴定抗虫鉴定抗病鉴定活性鉴定等个体水平的鉴定小结基因工程的基本内容基因操作的基本步骤基因操作的工具限制性内切酶DNA连接酶运载体目的基因与运载体结合目的基因的检测和表达将目的基因导入受体细胞目的基因的提取基因工程药品的生产基因诊断返回基因治疗（一）基因工程与医药卫生蛋白质工程蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础,通过基因修饰或基因合成,对现有蛋白质进行改造,或制造一种新的蛋白质,以满足人类的生产和生活的需求。蛋白质工程流程图1.从预期的蛋白质功能出发2.设计预期的蛋白质结构3.推测应用的氨基酸序列4.找到相应的脱氧核苷酸序列比较：基因工程和蛋白质工程基因工程蛋白质工程相同点都要改造基因，都属于分子水平产生新的基因型，无新基因基因（型）产生的蛋白质原有的新的联系蛋白质工程以基因工程为基础，是基因工程的应用和延伸32．用转基因技术培育出了抗TMV的烟草，主要流程如图-21所示。（1）经过程②获得的目的基因两侧除应含有相关的酶切位点外，目的基因的两端还必须有。（2）由图分析，构建的重组质粒上含有的标记基因是基因。（3）过程⑤采用的是植物组织培养技术，培养基中除含有卡那霉素及植物必需的各种营养成分外，还必须添加，以保证受体细胞能培养再生成植株。限制酶启运子和终止子卡那霉素抗性植物激素21．（6分，每空1分）下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图甲、图乙中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请回答下列问题：（1）一个图甲所示的质粒分子经SmaⅠ切割前后，分别含有、个游离的磷酸基团。（2）若对图中质粒进行改造，插入的SmaⅠ酶切位点越多，质粒的热稳定性越。（3）用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用SrnaⅠ切割，原因是。（4）为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入酶。（5）重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了。21．(6分，每空1分)（1）0、2（2）高（3）SmaⅠ会破坏质粒的抗性基因、外源DNA中的目的基因（4）DNA连接（5）鉴别和筛选含有目的基因的细胞专题2细胞工程细胞工程应用的原理和方法研究的水平研究的目的细胞生物学和分子生物学细胞整体水平或细胞器水平按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品概念分类植物细胞工程动物细胞工程植物细胞工程的理论基础是：植物细胞的全能性植物细胞工程常用的技术是植物组织培养植物体细胞杂交全能性高低：①受精卵＞胚胎干细胞＞生殖细胞＞体细胞②植物细胞＞动物细胞2.1.1植物细胞工程常用的技术植物组织培养•植物组织培养的条件•1）离体细胞、组织或器官•2）适宜的外界环境条件，例如无菌、适宜的温度、湿度、光照等•3）培养基（一定的营养物质，植物激素）植物组织培养的过程离体的植物器官、组织或细胞脱分化（又叫去分化）愈伤组织（排列疏松而无规则，高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞）再分化根或芽等器官植物体植物A细胞植物B细胞去壁原生质体A原生质体B原生质体融合融合体再生壁杂种细胞细胞分裂愈伤组织杂种植株去壁的常用方法：酶解法（纤维素酶、果胶酶等）原生质体融合方法：物理法：离心、振动、电刺激等化学法：聚乙二醇（PEG）植物体细胞杂交过程示意图概念：应用组织培养技术，快速繁殖植物（也叫快速繁殖技术）原理：植物细胞的全能性优点：繁殖率高，可大批量生产取材少培养周期短保持优良性状微型繁殖2.1.2植物细胞工程的实际应用作物脱毒病毒在作物体内逐年积累，会导致作物产量降低，品质变差分生区附近（茎尖、根尖）的病毒极少，甚至没有采用茎尖进行植物组织培养人工种子结构：人工薄膜+胚状体、不定芽、顶芽、腋芽技术：植物组织培养原理：植物细胞全能性单倍体育种方法：花药离体培养（植物组织培养）技术：组织培养获得单倍体秋水素处理单倍体的幼苗，使染色体加倍优点：明显缩短了育种年限后代稳定遗传2.1.2植物细胞工程的实际应用繁殖植物的新途径微型育种作物脱毒人工种子育种新方法单倍体育种诱导突变体细胞产物的工厂化生产细胞产物的工厂化生产红豆杉与紫杉醇人参皂甘的生产2.2动物细胞培养动物细胞融合单克隆抗体技术核移植动物细胞工程常用技术2、动物细胞培养过程：动物胚胎或幼龄动物的组织、器官细胞悬液胰蛋白酶10代细胞原代培养50代细胞传代培养细胞株无限传代细胞系单个细胞加培养液遗传物质未改变遗传物质已改变动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织和器官。（分解弹性纤维）细胞贴壁过程植物组织培养和动物细胞培养的比较比较项目植物组织培养动物细胞培养原理植物细胞的全能性细胞增殖培养基性质固体培养基液体培养基培养基特有成分蔗糖植物激素葡萄糖动物血清培养结果植物体细胞株、细胞系培养目的快速繁殖、培育无病毒植株获得细胞或细胞分泌蛋白2.2.21、动物细胞融合（细胞杂交）－2个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程细胞A细胞B杂交细胞灭活的病毒物理法化学法仙台病毒疱疹病毒新城鸡瘟病毒一、动物细胞融合植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较比较项目植物体细胞杂交动物细胞融合细胞融合原理细胞膜一定流动性、细胞膜一定流动性细胞融合的方法去除细胞壁后诱导原生质体融合使细胞分散后诱导细胞融合诱导方法物理（离心、振荡、电刺激）化学（聚乙二醇）物理、化学方法（同左）灭活的病毒用途获得杂种植株制备单克隆抗体单克隆抗体由单个B淋巴细胞经过无性繁殖（克隆），形成基因型相同的细胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体称为单克隆抗体。特点：特异性强、灵敏度高、能大量制备、如何大量生产单克隆抗体？利用B淋巴细胞产生抗体的功能利用肿瘤细胞无限增殖的特性利用细胞融合的技术将两种细胞融合获得具有淋巴细胞和肿瘤细胞特性的杂交瘤细胞利用动物细胞培养技术大量培养杂交瘤细胞单克隆抗体制备过程注射抗原B淋巴细胞骨髓瘤细胞细胞融合、筛选杂交瘤细胞细胞培养筛选，继续培养能产生特定抗体的细胞群体外培养注射到小鼠腹腔单克隆抗体1下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌抗体的实验方案2、该方案能达到预期效果吗？为什么？4、图中B为________过程，常用_________作为诱导剂，该细胞继承___________的遗传特性，既能__________,又能___________。1、该实验方案的目的是__________3、A是从小鼠的脾脏中取得_______,该细胞能够产生______5、C过程指细胞培养，该过程包括_____培养和_____培养两个阶段。制备单克隆抗体B细胞抗体细胞融合灭活病毒双亲细胞分泌特异性抗体无限增殖原代传代50B体外培养骨髓瘤细胞杂交瘤细胞足够数量的细胞群注射到小鼠腹腔AC2、下图是动物细胞培养的基本过程示意图。请据此图回答(1)容器A中放置的是动物器官或组织。它一般取自___________。(2)容器A中的动物器官或组织首先要进行的处理是__________，然后用酶处理，这是为了使细胞分散开来。这样做的目的是_______________.(3)培养首先在B瓶中进行。瓶中的培养基成分有__________等。(4)为了把B瓶中的细胞分装到C瓶中，用_____处理，然后配置成___________，再分装。(5)在C瓶中正常培养了一段时间后，发现细胞全部死亡。原因是_________________________。幼龄动物的器官或组织、动物胚胎剪碎胰蛋白使每个细胞能与培养液接触葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清胰蛋白酶细胞悬液细胞没有发生瘤癌变22．(11分，每空1分)下图为细胞融合的简略过程，请据图回答：(1)若A、B是植物细胞，在细胞融合之前已处理，一般用法除去；A、B到细胞C的过程中，常用的化学方法是用加以诱导。融合完成的标志是。(2)若A、B是植物细胞，则形成的D细胞一般应用技术把D培养成植株。(3)若A、B是动物细胞，一般取自，然后用处理使其分散开来。(4)若该过程是制备单克隆抗体，A为小鼠B淋巴细胞，那么，在获得此细胞之前，小鼠已被注射了，图中B为。在A、B到C的过程中，所形成的C有种，用来培养的D细胞应该是。22．(11分，每空1分)（1）酶解细胞壁聚乙二醇形成新的细胞壁（2）植物组织培养（3）幼龄动物组织或胚胎胰蛋白酶（4）相应的抗原骨髓