通过液质联用鉴定蛋白质相互作用方法的建立

２０１３年６月　　　　　第３４卷　第３期　　　　首都医科大学学报ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣａｐｉｔａｌＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　　　Ｊｕｎ．２０１３Ｖｏｌ３４　Ｎｏ３Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ，Ｅｍａｉｌ：[e-mail]网络出版时间：２０１３－０６－０９　０∶００　网络出版地址：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／１１．３６６２．Ｒ．２０１３０６０９．００００．００８．ｈｔｍｌ［ｄｏｉ：１０３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ１００６７７９５２０１３０３０２８］·技术方法·通过液质联用鉴定蛋白质相互作用方法的建立胡　家１　郑　帅２　胡　科３　殷爱红１（１．首都医科大学医学实验与测试中心，北京１０００６９；２．首都医科大学基础医学院生物化学与分子生物学系，北京１０００６９；３．首都师范大学生命科学学院细胞生物学系，北京１０００４８）　　蛋白质是生命功能的执行者，但大多数蛋白质并不能单独行使其功能，而是通过与其他蛋白质相互作用来参与细胞或组织的生理活动［１］。蛋白质组学研究的轰轰烈烈兴起开启了人们解析各种生命活动以及生理功能的新思路，近些年已经由比较蛋白质组学研究逐渐过渡到功能蛋白质组学研究。构建蛋白质相互作用网络能展示出两种以上蛋白质之间的相互依赖性以及这些蛋白质相互作用所起到的重要生理功能［２］。对于蛋白质相互作用研究的方法不断涌现，有蛋白芯片技术，Ｘ射线晶体学技术、酵母双杂交、带标签ｐｕｌｌｄｏｗｎ技术、免疫共沉淀技术、多肽阵列技术以及荧光显微镜技术［３］。首都医科大学医学实验与测试中心蛋白质组学研究测试室已经开展将ｐｕｌｌｄｏｗｎ或免疫共沉淀之后的样品再经液质联用来鉴定相互作用的蛋白，本文介绍一种通过谷胱甘肽ｓ转移酶（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅＳｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＧＳＴ）ｐｕｌｌｄｏｗｎ技术寻找大鼠肾组织中与诱饵蛋白相互作用的蛋白，再通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（ｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＳＤＳＰＡＧＥ）对ｐｕｌｌｄｏｗｎ样品进行分离，最后通过液质联用技术来鉴定与诱饵蛋白相互作用的其他蛋白的方法。１　材料和方法１１　材料１）实验样品：带ＧＳＴ标签的诱饵蛋白，ＺＳ蛋白（由于研究成果权限的原因，特此命名），其表达载体由首都医科大学贺俊崎教授实验室构建提供；大鼠［购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：ＳＣＸＫ（京）２０１２－０００１］肾组织也是该实验室提供。２）试剂：过硫酸铵，丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺，ＴＥＭＥＤ，二硫苏糖醇（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ，ＤＴＴ），碘乙酰胺，ＳＤＳ，甘氨酸，Ｔｒｉｓ，ＣＨＡＰＳ均为美国ＧＥ公司产品；胰蛋白酶（测序级）为美国Ｐｒｏｍｅｇａ公司产品；乙腈，甲酸，考马斯亮蓝Ｇ２５０为美国Ｓｉｇｍａ公司产品。１２　大鼠肾组织ＧＳＴｐｕｌｌｄｏｗｎ实验实验方法参考文章［４５］，取新鲜大鼠肾组织称质量后剪成碎块，用预冷的裂解缓冲液（ＨＥＰＥＳ１０ｍｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ７４，ＮａＣｌ５０ｍｍｏｌ／Ｌ，ＥＤＴＡ５ｍｍｏｌ／Ｌ，１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００，Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ１ｍｍｏｌ／Ｌ）以１０ｍＬ溶液：１ｇ组织的比例对大鼠肾组织进行蛋白质裂解，期间用匀浆器匀浆１０ｍｉｎ（１５Ｗ），再冰浴超声，条件设置为超声５ｓ，间歇５ｓ，共１２个循环，最后４℃，１３０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，取上清即为大鼠肾组织裂解液。将等量纯化好的ＧＳＴ和ＺＳ蛋白琼脂糖珠分别加入大鼠肾组织裂解液中，在４℃上下颠倒持续混合３ｈ，４℃，３０００ｒ／ｍｉｎ离心１ｍｉｎ收集沉淀，并用１ｍＬ预冷的洗涤液Ⅰ（ＨＥＰＥＳ１０ｍｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ７４，ＮａＣｌ５０ｍｍｏｌ／Ｌ，ＥＤＴＡ５ｍｍｏｌ／Ｌ，０１％Ｔｗｅｅｎ２０，３％ＢＳＡ，Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ１ｍｍｏｌ／Ｌ）洗涤沉淀，共洗涤４次，每次振荡洗涤完用４℃，３０００ｒ／ｍｉｎ离心１ｍｉｎ，收集沉淀，再用１ｍＬ预冷的洗涤液Ⅱ（ＨＥＰＥＳ１０ｍｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ７４，ＮａＣｌ５０ｍｍｏｌ／Ｌ，ＥＤＴＡ５ｍｍｏｌ／Ｌ，０１％Ｔｗｅｅｎ２０，Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ１ｍｍｏｌ／Ｌ）洗涤沉淀１次，最后４℃，３０００ｒ／ｍｉｎ离心１ｍｉｎ，收集沉淀，将此ＧＳＴｐｕｌｌｄｏｗｎ沉淀复合物中加入适量的一维电泳蛋白上样缓冲液，９５℃加热５ｍｉｎ使蛋白变性，离心后取上清进行ＳＤＳＰＡＧＥ，采用７ｃｍ凝胶，浓度为１０％，再用考马斯亮蓝染色电泳后凝胶。１３　胶内酶切根据ＰＡＧＥ凝胶的染色结果，从ＺＳ蛋白ｐｕｌｌｄｏｗｎ大鼠肾组织后的样品泳道上切下与对照差异有统计学意义的条带，将切下的条带再切碎成小颗粒，首都医科大学学报第３４卷经脱色，还原，烷基化，之后３０℃水浴酶切１８ｈ［６７］。１４　液质联用鉴定与ＺＳ蛋白相互作用蛋白将酶切完成的样品经超声振荡后，１５０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，取５μＬ上清进行纳升级液相与ＥＳＩ源离子阱质谱联用分析（ＢｒｕｋｅｒＤａｌｔｏｎｉｃｓ德国）。仪器由ＨｙＳｔａｒＴＭ３２和ＥｓｑｕｉｒｅＣｏｎｔｒｏｌＴＭ５２软件（ＢｒｕｋｅｒＤａｌｔｏｎｉｃｓ）控制。液相条件：ＥａｓｙＴＭＣ１８（２ｃｍ×１００μｍ，５μｍ）为富集柱；ＥａｓｙＴＭＣ１８（１０ｃｍ×７５μｍ，３μｍ）为分析柱；流速设３００ｎＬ／ｍｉｎ；流动相Ａ是含０１％甲酸的水溶液；流动相Ｂ为含０１％甲酸的乙腈。梯度设置为０ｍｉｎＢ液５％，０～４５ｍｉｎＢ液上升到３５％，４５～４７ｍｉｎ，Ｂ液上升到９５％，４９ｍｉｎＢ液９５％，共运行５０ｍｉｎ。质谱条件：离子化方式是纳升电喷雾正离子模式；每次扫描中５个强度最高的离子进行串联质谱分析；毛细管电压设４０００Ｖ；Ｓｋｉｍｍｅｒ电压设４０Ｖ；雾化装置压力００６９ＭＰａ；干燥气５Ｌ／ｍｉｎ，温度设２２０℃；采集范围：ＭＳ为２０～１５００Ｍ／Ｚ，ＭＳ／ＭＳ为１００～２５００Ｍ／Ｚ。数据分析软件：ＤａｔａＡｎａｌｙｓｉｓ４０；数据经软件分析之后通过Ｍａｓｃｏｔ检索软件检索本地ＳｗｉｓｓＰｏｒｔ（２０１００５）中的大鼠数据库，检索条件设为，Ｔｒｙｐｓｉｎ酶切，固定修饰选择Ｍ氧化，可变修饰为碘乙酰胺烷基化，漏切位点为１，ＭＳ质量数误差０４％，ＭＳ／ＭＳ的质量数误差为０７，所用仪器选ＥＳＩＴｒａｐ。依据ＭＡＳＣＯＴ算法，匹配肽段数在３条以上，并且得分（ｓｃｏｒｅ值）在可信区间内的蛋白为成功鉴定到的蛋白。２　实验结果２１　ＺＳ蛋白ｐｕｌｌｄｏｗｎ大鼠肾组织结果从图１中可看出ＺＳ蛋白ｐｕｌｌｄｏｗｎ大鼠肾组织裂解液的样品泳道（图中标注为３）比ＧＳＴｐｕｌｌｄｏｗｎ样品泳道（图中标注为２）在相对分子质量５５０００与７２０００之间明显多出一个条带，标注为＃，再对应大鼠肾组织裂解液（ｌｙｓａｔｅ）泳道（图中标注为１）和右侧的ＺＳ蛋白泳道（图中标注为４）显示，在ＺＳ蛋白泳道相应位置并未出现此条带，在Ｌｙｓａｔｅ泳道此处有条带，这说明该条带是大鼠肾组织裂解液中由ＺＳ蛋白ｐｕｌｌｄｏｗｎ下来的成分。２２　液质联用鉴定结果将此特异性条带（标记为＃）切下之后进行胶内酶切，用酶解原液直接上样，经纳升级液相分离之后由ＥＳＩ源离子阱质谱检测。图２是样品的基峰离子流图（ｂａｓｅｐｅａｋｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ，ＢＰＣ），由每个时间点质谱图图１　ＧＳＴｐｕｌｌｄｏｗｎ实验寻找大鼠肾组织裂解液中与ＺＳ蛋白相互作用的蛋白，所得沉淀经ＳＤＳＰＡＧＥ电泳后结果Ｆｉｇ１　ＳｃｒｅｅｎｉｎｇｏｆＺＳｂｉｎｄｉｎｇｐａｒｔｎｅｒｓｂｙＧＳＴｐｕｌｌｄｏｗｎａｓｓａｙ．ＴｈｅｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｓｗｅｒｅｒｕｎｏｎＳＤＳＰＡＧＥＭ：ｍａｒｋｅｒ；１：ｌｙｓａｔｅｏｆｒａｔ’ｓｋｉｄｎｅｙ；２：ｐｕｌｌｄｏｗｎａｎａｌｙｓｉｓｗｉｔｈＧＳＴｐｒｏｔｅｉｎ；３：ｐｕｌｌｄｏｗｎａｎａｌｙｓｉｓｗｉｔｈＺＳ；４：ＺＳ；ＧＳＴ：ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅｓｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；＃：Ｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｂａｎｄｆｒｏｍｌｙｓａｔｅｏｆｒａｔ’ｓｋｉｄｎｅｙｗａｓｓｔｒｏｎｇｌｙｂｏｕｎｄｔｏｔｈｅＺＳ．中最强离子的强度连续描绘所得。由ＢＰＣ可看出，从１２ｍｉｎ开始出峰，到４５ｍｉｎＢ相即有机相从５％升至３５％样品基本洗脱完全，液相梯度设置合适，对样品的分离效果很好。液相每时每刻分离的样品进到质谱里进行检测，每个时刻将检测到的强度最高的５个离子作为母离子进行碎裂，做二级质谱（ＭＳ／ＭＳ），所得一级、二级质谱峰进过软件分析再通过数据库检索，由ＭＡＳＣＯＴ算法得出Ｓｃｏｒｅ值超过３９分的为可信鉴定结果。本研究共鉴定出３２种蛋白（表１）。图３显示二氢嘧啶酶（ｄｉｈｙｄｒｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎａｓｅ）的质谱鉴定情况。该蛋白是鉴定结果中得分最高的蛋白质，有１２７条序列与数据库高度匹配，其中一条得分最高的序列Ｋ．ＩＰＮＧＶＮＧＶＥＤＲ．Ｍ，是质荷比（Ｍ／Ｚ）为５８５３的母离子经过离子阱的碰撞诱导裂解（ｃｏｌｌｉｓｉｏｎｉｎｄｕｃｅｄｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，ＣＩＤ）之后鉴定所得。在１７１ｍｉｎ时，该多肽从液相中大量洗脱出来，经质谱分析得到一级质谱峰如图３（Ａ），该母离子为二价形式即（Ｍ＋２Ｈ）２＋，经二级碎裂后所得质谱峰如图３（Ｂ）。３　讨论Ｐｕｌｌｄｏｗｎ技术是由Ｓｍｉｔｈ及其研究团队于１９８８年利用ＧＳＴ融合标签纯化出ＧＳＴ融合蛋白，由此该技术开始成为一种热门研究方法［１，８］。该技术特２６４第３期胡　家等：通过液质联用鉴定蛋白质相互作用方法的建立表１　＃蛋白条带经液相色谱质谱联用鉴定结果Ｔａｂ１　Ｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｂａｎｄ＃ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｅｌｅｃｔｒｏｓｐａｒｙｉｏｎｉｚａｔｉｏｎｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙｔａｎｄｅｍｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（ＬＣＭＳ／ＭＳ）ＡｃｃｅｓｓｉｏｎｃｏｄｅＰｒｏｔｅｉｎｎａｍｅＴｏｔａｌｓｃｏｒｅＭａｓｓＭａｔｃｈｐｅｐｔｉｄｅｓＱ６３１５０Ｄｉｈｙｄｒｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎａｓｅ９３３５７２９２１２７Ｑ０２２５３Ｍｅｔｈｙｌｍａｌｏｎａｔｅｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ５６２５８２２７６１Ｐ６３０３９６００００ｈｅａｔｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎ２５７６１０８８３１Ｑ６８ＦＳ４Ｃｙｔｏｓｏｌａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ１８０５６５１４１７Ｐ１１５９８ＰｒｏｔｅｉｎｄｉｓｕｌｆｉｄｅｉｓｏｍｅｒａｓｅＡ３１７７５７０４４３１Ｐ０７３１４Ｇａｍｍａｇｌｕｔａｍｙｌｔｒａｎｓｐｅｐｔｉｄａｓｅ１７２６１９１３１６Ｐ３１９７７Ｅｚｒｉｎ１６３６９４６２３１Ｑ６Ｐ６Ｒ２Ｄｉｈｙｄｒｏｌｉｐｏｙｌｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ１３３５４５７４１８Ｑ６８ＦＴ３Ｐｙｒｉｄｉｎｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｄｉｓｕｌｆｉｄｅｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅｄｏｍａｉｎｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ２１２８６３４１０１２Ｑ５ＸＩＴ９ＭｅｔｈｙｌｃｒｏｔｏｎｏｙｌＣｏＡｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅｂｅｔａｃｈａｉｎ１２５６１９９２１６Ｑ６４０５７Ａｌｐｈａａｍｉｎｏａｄｉｐｉｃｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ１１５５９２２５２０Ｐ０５１９７Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ２１１４９６１９２３２Ｏ７０１９９ＵＤＰｇｌｕｃｏｓｅ６ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ１０９５５５４２１１Ｑ６ＳＫＧ１ＡｃｙｌｃｏｅｎｚｙｍｅＡｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ１００６６２４１１１Ｏ０８６５１Ｄ３ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ９７５７２５６１３Ｑ５Ｉ０Ｄ７ＸａａＰｒｏｄｉｐｅｐｔｉｄａｓｅ８６５５６８４７Ｑ５Ｍ７Ｔ９Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅｓｙｎｔｈａｓｅｌｉｋｅ８４５４８４４１５Ｐ０４７６２Ｃａｔａｌａｓｅ８２６００６２９Ｑ３ＭＩＦ４Ｘｙｌｕｌｏｓｅｋｉｎａｓｅ８１５８７８８１０Ｏ３５７６３Ｍｏｅ