SDS-PAGE检测重组蛋白

SDS-PAGE检测重组蛋白一、实验目的①掌握SDS-PAGE的基本原理；②掌握SDS-PAGE的凝胶制备方法；③掌握蛋白质的考马斯亮蓝染色法；④掌握测定重组蛋白分子量的方法。二、实验原理：1、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegelelectrophoresis），简称PAGE，是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质。聚丙烯酰胺凝胶是由单体的丙烯酰胺（acrylamide）和甲叉双丙烯酰胺（bisacrylamide）聚合而成，这一聚合过程需要有自由基催化完成。催化剂过硫酸铵（AP）可产生自由基，而加速剂四甲基乙二胺（TEMED）可催化过硫酸铵加速自由基的产生，这样就可以形成丙烯酰胺长链，同时甲叉双丙烯酰胺在不断延长的丙烯酰胺链间形成甲叉键交联，从而形成交联的三维网状结构。氧气对自由基有清除的作用，在制备聚丙烯酰胺凝胶时通常要进行抽气，或者用水或正丁醇隔绝氧气。聚丙烯酰胺凝胶的孔径可以通过改变丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺单体的浓度来控制，丙烯酰胺的浓度可以在3~30%（V/V）之间。低浓度的凝胶具有较大的孔径，如3%（V/V）的聚丙烯酰胺凝胶对蛋白质没有明显的阻碍作用，可用于SDS-PAGE的浓缩胶，也可以用于分离DNA。高浓度凝胶具有较小的孔径，对蛋白质有分子筛的作用，可以用于根据蛋白质的分子量进行分离的电泳中，如10~20%（V/V）的凝胶常用于SDS-PAGE的分离胶。聚丙烯酰胺凝胶具有以下突出的优点：（1）可以随意控制胶浓度和交联度，从而得到不同的有效孔径，用于分离不同分子量的生物大分子；（2）能把分子筛作用和电荷效应结合在同一方法中，达到更高的灵敏度：10-9~10-12mol/L；（3）由于聚丙烯酰胺凝胶是由-C-C-键结合的酰胺多聚物，侧链只有不活泼的酰胺基-CO-NH2-，没有带电的其他离子基团，化学惰性好，电泳时不会产生“电渗”；（4）由于可以制得高纯度的单体原料，因而电泳分离的重复性好；（5）透明度好，便于照相、扫描或复印。机械强度好，有弹性，不容易破碎，便于操作和保存；（6）无紫外吸收，不需染色就可以用于紫外波长的凝胶扫描作定量分析；（7）还可以用作固定化酶的惰性载体。聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质最初是在玻璃管中进行的，后来发展起来的垂直平板电泳一次最多可以容纳20多个样品，电泳过程中样品所处的条件比较一致，样品间可以进行更好的比较，重复性也更好，所以垂直平板电泳目前应用得最更为广泛，常用于蛋白质的分离和分子量的测定，以及DNA序列分析过程中的DNA片段的分离和鉴定。2、SDS-PAGE十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是根据SDS和还原剂将蛋白质分子解聚后亚基的大小，在恒定pH（碱性）缓冲体系中的分离。主要用于测定蛋白质亚基的分子量。与超速离心、凝胶过滤相比，SDS-PAGE不需要昂贵的仪器设备，操作简便，能在几个小时内得到结果，有较高的重复性，且不需要非常纯的样品，是目前为大家所接受的用于测定亚基的分子量的一种最好的方法。这个方法可用于多肽分子量的分析，或用于变性蛋白的分离等。SDS是一种阴离子去污剂，作为变性剂和助溶剂，能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级结构和三级结构。强还原剂，如β-巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）则能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，在100℃加热3~5分钟，分子被解聚为组成它们的多肽链。解聚后的氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，这就消除了不同分子之间原有的电荷差异。因此，结合了SDS的蛋白质可以在聚丙烯酰胺凝胶中向正极泳动，同时由于聚丙烯酰胺凝胶的分子筛效应，蛋白质在凝胶中的迁移率主要决定于自身分子量的大小，即分子量小的蛋白质分子通过凝胶孔的阻力小，迁移快，而分子量大的蛋白质分子通过凝胶孔的阻力大，迁移慢。SDS-PAGE分离不同蛋白质时的高分辨率，不仅是因为聚丙烯酰胺凝胶介质本身的特点，还归功于在电泳时采用了不连续系统。不连续系统对样品具有浓缩效应，从而提高了分离效果。（1）凝胶层的不连续。浓缩胶的孔径大，分离胶孔径小，在电场的作用下，蛋白质颗粒在大孔胶中泳动时遇到的阻力小，移动快，而在小孔胶中移动慢。因而在两层凝胶交界处，由于凝胶孔径的不连续性，使样品迁移受阻，而压缩成很窄的区带。（2）缓冲液离子成分及pH的不连续。在两层凝胶中均有Tris（三羟甲基氨基甲烷）及HCl。Tris的作用是维持溶液的电中性及pH值，是缓冲配对离子，HCl在任何pH值溶液中均易解离出Cl-（氯离子），它在电场中迁移率大，走在最前面，故称为快离子或前导离子。电极缓冲液中的Gly（甘氨酸）在pH6.8的缓冲体系中解离度很小，仅0.1-1%，因而在电场中迁移率很小，称为慢离子或尾随离子。蛋白质-SDS复合物带有负电荷，在pH6.8的浓缩胶中，向正极泳动，迁移率介于快慢离子之间，于是蛋白质就在快慢离子间形成的界面处，被浓缩成极窄的区带。当蛋白质进入pH8.8的分离胶中，Gly的解离度增加，其迁移率就超过蛋白质，因此氯离子和甘氨酸离子沿着离子界面继续前进。蛋白质由于分子量大，被留在后面，然后分成多个区带，因此浓缩胶与分离胶之间pH值的不连续性，能控制迁移率：在浓缩胶中，要求慢离子较所有被分离样品的有效迁移率低，以使样品在快慢界面之间被浓缩；进入分离胶后，慢离子的有效迁移率比所有样品的有效迁移率高，使样品不再受离子界面的影响。（3）电位梯度的不连续。电位梯度的高低与电泳速度的快慢有关（V=mE）。电泳开始后，由于快离子迁移率大，就会很快超过蛋白质，在快离子后面形成一个离子浓度低的区域即低电导区，有较高的电位梯度，使蛋白质和慢离子在快离子后面加速泳动。当三者的迁移率与电位梯度的乘积彼此相等时，三者的泳动速度就相等。在快慢离子的移动速度相等的稳态建立后，二者之间形成一个稳定而又不断向阳极移动的界面，而蛋白质的有效迁移率在快慢离子之间，因此也就聚集在这个移动附近，被压缩成一个狭小的中间层。3、蛋白质（亚基）分子量的测定蛋白质-SDS胶束在水溶液中的形态，就像一个长椭圆棒，椭圆棒的短轴对不同的蛋白质亚基-SDS胶束而言，基本上都是相同的，约为1.8nm。但长轴的长度则与亚基分子量的大小成正比。因此这种胶束在进行SDS-PAGE时，电泳迁移率不再受到蛋白质原有电荷的影响，而主要取决于椭圆棒的长轴长度，即取决于蛋白质或亚基分子量的大小。当蛋白质亚基的分子量在15~200kDa之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。由此可见，SDS-PAGE不仅可以分离蛋白质，而且可以根据迁移率大小测定蛋白质亚基的分子量。蛋白质或亚基分子量的测定，可根据蛋白质标准（蛋白质Marker）测定，或根据相对迁移率进而更精确地测定分子量。现在市售的蛋白质Marker大多是由一系列纯化的、具有不同分子量的蛋白质组成的，它们之间不会发生相互作用，在进行SDS-PAGE时具有良好的线性关系。例如本实验中采用的低分子量蛋白质Marker为BBI公司产品，由磷酸酶b（兔子肌肉）、牛血清蛋白（牛）、卵清蛋白（鸡蛋白）、碳酸苷酶（牛）、溶菌酶（鸡蛋白）五种蛋白质组成，其分子量依次为97.4kD，66.2kD，42.7kD，31.0kD，14.4kD。在电泳时，将蛋白质Marker点入与样品相邻的泳道，其各蛋白质组分将在电泳过程中相互分离。根据分子量相近的蛋白质具有相近的迁移率这一原则，可以借助于蛋白质Marker初步确定目的蛋白的分子量。为了在电泳时即时观察蛋白质的分离情况，还可以采用已经经过着色的蛋白质Marker，通常称为“彩虹”蛋白质Marker。另外，我们还可以根据蛋白质Marker中各种蛋白质的相对迁移率，作出标准曲线，从而更精确地测定目的蛋白的分子量。蛋白质的迁移距离，即从分离胶的上沿至蛋白带的中央的距离，可以用直尺直接测得，而蛋白质的相对迁移率Rf是用每个蛋白带的迁移距离除以溴酚蓝的迁移距离得到，即：Rf=蛋白带的迁移距离/溴酚蓝的迁移距离如果凝胶厚度大于1mm，由于染色、脱色和保存过程中凝胶的膨胀或收缩，所以必须测量固定前和干燥后的凝胶的尺寸来消除这种误差，其公式为：Rf=（蛋白带的迁移距离/干燥后的凝胶长度）×（固定前的凝胶长度/溴酚蓝的迁移距离）用每个标准蛋白的分子量的对数（纵坐标）对它的相对迁移率（横坐标）作图就能得到一条直线。量出目的蛋白的迁移距离，计算出相对迁移率，就可以根据标准曲线计算出其分子量。不同，这样的标准曲线只对同一块凝胶上的样品的分子量的测定才具有可靠性。此外，使用凝胶扫描或影像文件处理系统，便可以很快读出目的蛋白的分子量。三、实验材料1、生物材料经IPTG诱导的含有重组质粒pET28a-egfp，pET28a-rfp或pET28a-Dvgst的基因工程菌的总蛋白（由实验二获得）。2、主要试剂（1）用于SDS-PAGE凝胶的制备：30%丙烯酰胺凝胶母液（丙烯酰胺:双甲叉丙烯酰胺=29:1），20%SDS，1.5MTris-HCl（pH6.8），1.0MTris-HCl（pH8.8），10%过硫酸铵（AP），四甲基乙二胺（TEMED），去离子水；（2）用于SDS-PAGE凝胶的电泳：1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液；（3）用于SDS-PAGE凝胶的考马斯亮蓝染色：甲醇，乙酸，考马斯亮蓝；（4）用于SDS-PAGE凝胶的硝酸银染色：乙醇，乙酸，乙酸钠，25%戊二醛，硫代硫酸钠，，硝酸银，甲醛，碳酸钠，EDTA-Na22H2O。3、主要仪器玻璃制胶板，垂直电泳槽，电泳仪，染色与脱色摇床，凝胶成像系统。四、实验步骤1、SDS-PAGE凝胶的制备（1）正确安装制胶板，用琼脂糖凝胶密封底部及侧面，以免PAGE胶液泄漏。（2）在150ml三角瓶中配置80ml12%分离胶，混匀，沿玻璃板边缘缓缓加入制胶槽，加至距梳齿约1cm处，留出浓缩胶的空间。12%分离胶（80ml）：26.8mlH2O，32.0ml30%凝胶母液，20.0ml1.5MTris（pH8.8），0.4ml20%SDS，0.8ml10%AP，32µlTEMED。注意：丙烯酰胺具有一定的神经毒性，操作时戴一次性手套；加入凝胶时动作要轻缓，以免产生气泡。（3）用1ml移液器轻轻加入适量去离子水作为覆盖层静置约30min使凝胶完全聚合。注意：水作为覆盖层可使凝胶表面变得平整，并可防止氧气对凝胶聚合反应的抑制作用。（4）倒出覆盖层中的水，去离子水洗涤凝胶顶部数次，以去除未参与聚合反应的丙烯酰胺，用纸巾吸尽残留液体。（5）在150ml三角瓶中配置40ml5%浓缩胶，混匀，轻轻加在分离胶上面，插入梳子，静置约30min，使凝胶完全聚合。5%浓缩胶（40ml）：27.4mlH2O，6.8ml30%凝胶母液，5.0ml1.0MTris（pH6.8），0.2ml20%SDS，0.6ml10%AP，24µlTEMED。注意：加入浓缩胶时动作要轻缓，以免产生气泡；插入梳子时避免在梳齿下方产生气泡。（8）在垂直电泳槽中加入1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液，轻轻拔出梳子，用滴管或移液器轻轻冲洗加样孔，去除未聚合的丙烯酰胺，并用细针拨直凝胶齿。1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：25mMTris，250mM甘氨酸，0.1%SDS。2、点样与电泳（1）点样：在加样孔中依次加入15l样品：0h、1h、2h、3h、4h，并在样品的相邻泳道点入蛋白质Marker。（2）电泳：接通电源，起始电压80V；当染料前沿进入分离胶后，提高电压至120V，电泳约2-5h。（3）待溴酚蓝前沿到达电泳槽底部时，切断电源，戴手套取出玻璃板，小心从玻璃板上剥下凝胶以免破损，弃除浓缩胶，在分离胶右下角切去一小片，作为定位标记。3、考马斯亮蓝染色与脱色（1）将分离胶放入染色液，置摇床上缓慢摇动，染色4h以上或过夜。染色液：90ml甲醇:水（1:1），10ml乙酸，0.25g考马斯亮蓝。注意：戴一次性手套操作，以免手上染色。（2）取出分离胶