酶免疫技术

第九章酶免疫技术第一节酶免疫技术的特点一、酶和酶作用底物二、酶标记抗体或抗原三、固相载体第二节酶免疫技术的分类一、均相酶免疫测定二、非均相酶免疫测定第三节酶联免疫吸附试验一、基本原理二、方法类型及反应原理思考题小结放射免疫技术发光免疫技术酶免疫技术三大经典标记技术三大经典标记技术第一节酶免疫技术的特点•主要试剂:酶标记的抗体或抗原•酶标物特点：免疫学活性酶对底物的催化活性抗原抗体反应的特异性+酶高效催化反应的专一性原理及特点特点：灵敏度高、特异性强、准确性好酶标记试剂能够较长时间保持稳定操作简便、对环境没有污染。易与其它技术偶联衍生出适用范围更广的新方法。原理：酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应酶对底物的显色反应对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析原理及特点标记酶的要求：活性高性质稳定专一性强酶催化底物的显色信号易于判断和测量方法敏感，重复性好，简单易行酶的底物易于配制保存，酶及底物价廉一、酶和酶作用底物辣根过氧化物酶（HRP）糖蛋白（主酶）亚铁血红素（辅基）主酶与酶活性无关辅基是酶的活性中心RZ值：403nm（辅基）与275nm（主酶）OD值之比RZ值与酶活性无关，酶活性单位比RZ值更为重要ELISA中应用最为广泛的标记用酶常用酶酶和酶作用底物碱性磷酸酶（AP）菌源性AP肠粘膜APβ–半乳糖苷酶（β-Gal）用于均相酶免疫测定常用酶酶和酶作用底物HRP的底物DH2+H2O2→→→D+2H2OHRP供氢体DH2习惯上被称为底物，底物有多种H2O2为受氢体，HRP对受氢体的专一性很高常用底物酶和酶作用底物HRP的常见底物邻苯二胺OPD四甲基联苯胺TMB5-氨基水杨酸5-ASA2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)铵盐ABTS常用底物酶和酶作用底物OPD反应后显橙黄色，加酸终止反应后呈棕黄色，测定波长492nm。不稳定，致癌性。TMB反应后显蓝色，加酸终止反应后变为黄色,测定波长450nm，稳定，无致癌性，ELISA中应用最广泛的底物。HRP的常见底物酶和酶作用底物AP的底物β-Gal的底物对-硝基苯磷酸酯（pNPP）4-甲基伞酮基β-D半-乳糖苷（4MUG）经AP作用后的产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为405nm。酶作用后，生成高强度荧光物，用荧光计测量。常用底物酶和酶作用底物酶免疫技术的核心组成部分酶结合物（conjugate）酶标记物通过化学反应或免疫学反应，让酶与抗体或抗原形成的结合物二、酶标记抗体或抗原抗原要求纯度高，抗原性完整抗体需要特异性好、效价高、亲合力强以及比活性较高，能批量生产，易纯化。制备方法要求酶标记抗体或抗原制备方法要求技术方法简单、产率高，重复性好标记反应不影响酶和抗原或抗体的活性酶标记物稳定，不形成聚合物酶标记抗体或抗原制备方法过碘酸钠法（直接法）常用于HRP标记抗体或抗原戊二醛交联法酶标记抗体或抗原戊二醛交联法戊二醛分子中有两个相同的醛基，可分别与HRP和蛋白质分子中的氨基结合。该法有一步法和二步法。二步法标记效率比一步法高，酶标记物质量较均一。酶标记抗体或抗原纯化及鉴定标记完成后应除去反应液中的游离酶、游离抗体或抗原、酶聚合物以及抗体或抗原聚合物，避免游离酶增加非特异显色，以及游离抗体或抗原起竞争作用而降低特异性染色强度常用的纯化方法：葡聚糖凝胶G-200/G-150过柱层析纯化50%饱和硫酸铵沉淀提纯酶标记抗体或抗原固相抗体或抗原是非均相酶免技术中将游离和结合的酶标记物迅速分离的最常用方法固相抗体或抗原就是把抗体或抗原结合到固相载体的表面三、固相载体要求•结合抗体或抗原的容量大•抗体或抗原牢固地固定在其表面•不影响免疫反应性•利于反应充分进行•固相方法简便易行，快速经济种类•塑料制品•微颗粒•膜载体固相载体将抗原或抗体结合于固相载体用1%～5%的牛血清白蛋白或5%～20%小牛血清消除固相载体表面未结合的位点，消除非特异性吸附包被coating封闭blocking包被与封闭第二节酶免疫技术分类酶免疫技术酶免疫组化酶免疫测定均相非均相固相酶免疫测定液相酶免疫测定组织切片或其它标本中抗原的定位液体标本中抗原或抗体的定性和定量用于小分子激素和半抗原（如药物）的测定酶标记物与相应的抗原或抗体结合后，标记酶的活性会发生改变，不用分离结合和游离酶标记物，通过测定标记酶的活性的改变，而确定抗原或抗体的含量。原理一、均相酶免疫测定最具代表性的两种技术酶放大免疫测定技术EMITenzyme-mutipliedimmunoassaytechnique克隆酶供体免疫分析CEDIAclonedenzymedonorimmunoassay均相酶免疫测定EMIT示意图CEDIA示意图分类：液相酶免疫测定固相酶免疫测定以聚苯乙烯等材料作为固相载体的酶联免疫吸附试验（ELISA）是目前最为常用的固相酶免疫测定与均相不同之处需分离游离与结合的酶标记物二、非均相酶免疫测定第三节酶联免疫吸附试验底物显色定性或定量的分析原理包被反应加入待测抗体或抗原和酶标抗原或抗体洗涤使结合在固相上的抗原抗体复合物与未结合的分离1234一、基本原理固相的抗原或抗体酶标记物（酶结合物）酶反应的底物三个必要试剂二、方法类型及反应原理双抗体夹心法方法：用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶标抗体，加底物显色应用：二价或二价以上的较大分子抗原测定乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等ELISA检测抗原的方法双抗体夹心法测抗原+-EEEEEEEEE竞争法方法：用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色。应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药物、激素等）ELISA检测抗原的方法竞争法测抗原+-EEEEEEE2、加待检物抗原与酶标抗原竞争与抗体结合3、加酶作用的底物不显色或显色弱3、加酶作用的底物显色1、已知抗体包被于载体表面1、已知抗体包被于载体表面2、加待测物和酶标抗原，酶标抗原与抗体结合E间接法方法用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗人IgG（抗抗体或二抗）加底物显色。优点一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体应用常用于HCV抗体、HIV抗体和梅毒螺旋体抗体等的测定ELISA检测抗体的方法间接法测抗体-EEEEEEEEE+双抗原夹心法原理：类似双抗体夹心法操作步骤：类似应用：乙型肝炎表面抗体ELISA检测抗体的方法竞争法原理：类似检测抗原的竞争法应用：乙型肝炎病毒核心抗体(HBcAb)和乙型肝炎病毒e抗体(HBeAb)的检测ELISA检测抗体的方法捕获法应用：病原体急性感染诊断中的IgM型抗体甲型肝炎HAV-IgM抗体乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗体ELISA检测抗体的方法捕获法原理：抗人IgMμ链抗体包被捕获待测标本中IgM类抗体加入特异性抗原和酶标记特异性抗原的抗体底物显色捕获法原理+-EEEEE1、固相化抗人IgM1、固相化抗人IgM2、加待测物特异性IgM与非特异性IgM和抗人IgM结合3、加特异性抗原，与特异性抗体结合4、加酶标抗体与特异性抗原结合，加底物显色2、加待测物只有非特异性IgM和抗人IgM结合3、加特异性抗原，不能与非特异性IgM结合4、加酶标抗体无抗原结合，加底物不显色第四节酶免疫测定的应用均相酶免疫测定主要用于药物和小分子物质的检测。非均相免疫测定中的ELISA应用更为广泛，ELISA广泛用于传染病的诊断，病毒如病毒性肝炎（甲肝抗体、“乙肝三对”、丙肝抗体、丁肝抗体、戊肝抗体）、风疹病毒、疱疹病毒、轮状病毒等；细菌如结核杆菌、幽门螺杆菌等。也用于一些蛋白质检测，如各种免疫球蛋白、补体、肿瘤标志物（甲胎蛋白、癌胚抗原、前列腺特异性抗原等）。1．酶免疫技术的要点？2．酶联免疫吸附试验的原理（ELISA）？3．竞争法在酶联免疫检测应用中的原理和应用？4．常用的底物有哪几类？特点？5．常用的酶有哪几类？特点？6．何谓包被与封闭？其作用？7．常用固相载体的种类和特点？8．举例固相酶免疫测定应用的原理及影响因素。9．ELISA的非特异性干扰有哪些，其机制？10．对酶免疫技术的应用评价如何？思考题•酶免疫技术是标记免疫技术的一种，它是以酶标记的抗原或抗体作为主要试剂的免疫检测方法，在抗原与抗体的特异性反应完成后，通过酶对底物的作用进一步提高敏感性。酶免疫技术可分为酶免疫组织化学技术和酶免疫测定两大类,后者根据抗原抗体反应后是否需要分离结合与游离的酶标记物而分为均相和非均相两种类型。•均相酶免疫测定主要用于小分子激素和半抗原的测定，非均相酶免疫测定根据是否使用固相支持物，又可分为液相和固相酶免疫测定两种类型。最常用的是以聚苯乙烯等材料作为固相载体的酶联免疫吸附试验（ELISA）,其原理可以有夹心法、竞争法、间接法和捕获法等。小结