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微生物检验技术讲授:周慧恒一、第一讲二、第二讲三、第三讲四、第四讲五、第五讲六、第六讲七、第七讲八、第八讲九、第九讲十、第十讲目录一、实训一二、实训二三、实训三四、实训四五、实训五六、实训六七、实训七八、实训八实训第一讲：微生物及微生物检验概述1、什么是微生物酿酒、天花，列文虎克、巴斯德、科赫远古人类发现，吃剩的米粥数日后变成了醇香可口的饮料—人类最早发明的酒天花是感染痘病毒引起的，无药可治，每4名天花病人当中便有一人死亡，而剩余的3人却要留下丑陋的痘痕。明代以后，人痘接种法盛行起来。到目前为止，天花是在在世界范围被人类消灭或控制的第一个传染病。天花病毒安东·列文虎克荷兰格拉夫霍霍夫利特微生物的鼻祖无孔不入的微生物，何时何地不在与人们打交道。甚至在我们体内到处安营扎寨，自由出入。可是，人们不肉眼看见它们，因而几千年来，人类竟不知道世界上还有微生物这东西存在。直到1673年列文虎克用自制显微镜发现了“小动物”的微生物世界！他一生当中磨制500多个镜片，制造400多种显微镜，其中只有9种至今仍有人使用。虽然他活着的时候就看到人们承认了他的发现，但要等到100多年以后，当人们在用效率更高的显微镜重新观察列文虎克描述的“小动物”，并知道他们会引起人类严重疾病和产生许多有用物质时，才真正认识到列文虎克对人类认识世界所作出的伟大贡献。法国科学家路易斯·巴斯德(1822-1895)被后人誉为“微生物学之父”。证实发酵由微生物引起免疫学—预防接种鹅颈烧瓶实验也创造了一种有效的灭菌方法——巴氏灭菌法。反驳微生物自然发生说鹅颈烧瓶实验科学虽没有国界，但科学家却有自己的祖国德国的波恩大学普法战争爆发传染病是人类健康的大敌。从古至今，鼠疫、伤寒、霍乱、肺结核等许多可怕的病魔夺去了人类无数的生命。人类要战胜这些疾病，首先要弄清楚致病的原因。而第一个发现传染病是由病原细菌感染造成的人就是罗伯特·科赫。罗伯特·科赫（1843—1910）-德国医学家罗伯特。科赫发现结核杆菌一百周年被后人尊为细菌学鼻祖，传染病的克星，细菌学的奠基人和开拓者2003年，经过全球10个国家的科学家的共同努力，终于确认了冠状病毒是SARS的病原体。最终判定这种冠状病毒是否真正的元凶，依靠的是100多年前德国伟大的细菌学家科赫提出的“科赫原则”。1870结婚-1900年30岁生日-19102、微生物的特点1.个体微小，结构简单2.分布广，种类多3.繁殖快，数量大4.易于变异，适应力强5.易于培养，代谢活力强3、微生物对产品的污染食品中的微生物直接致病微生物相对致病微生物非致病微生物腐败变质特殊条件下致病食源性疾病或食物中毒直接致病微生物：致病性的细菌、人畜共患传染病病原菌和病毒、产毒霉菌和霉菌毒素，可直接对人体致病和造成危害。沙门氏菌、痢疾杆菌、副溶血性弧菌、致病性大肠杆菌、肉毒梭菌等结核杆菌、布氏杆菌、炭疽杆菌相对（条件）致病微生物–通常条件下不致病，在一定特殊条件下才有致病力的微生物。–葡萄球菌、链球菌、变形杆菌、蜡样芽胞杆菌等贮存方式不当人体抵抗力下降非致病微生物–对人体本身无害、是引起食品腐败变质、卫生质量下降的主要原因。因此又叫腐败菌–非致病菌、不产毒霉菌以及酵母–假单胞菌属、黄杆菌属、产硷杆菌属、芽胞杆菌属、梭状芽胞杆菌。4、污染的预防与控制低温保藏高温保藏干燥腌制微生物食品pHaw消毒--杀灭或清除传播媒介上病原微生物，使其达到无害化的FF。灭菌--用物理和化学方法杀灭或清除传播媒介上一切微生物的方法。利用温度进行灭菌、消毒或防腐，是最常用而又方便有效的方法。高温可使微生物细胞内的蛋白质和酶类发生变性而失活，从而起灭菌作用。低温通常起抑菌作用。嗜冷微生物适合于－10℃生活的细菌，最适生长温度在20℃左右。嗜温微生物生长温度在15～45℃之间，最适生长温度在37℃左右的细菌。嗜热微生物生长温度在30～75℃之间，最适生长温度在55℃，在100℃以上温度生长，称为嗜高热微生物。微生物热死温度(℃)时间时间(分)金黄色葡萄球菌637大肠杆菌605~30沙门氏菌605酵母菌50~6010~15霉菌605~10消毒与灭菌方法a、干热灭菌法1.火焰灭菌（酒精灯）2.干热灭菌（电热干燥箱）b、湿热灭菌法1.巴氏消毒2.煮沸消毒3.间歇灭菌法4.加热蒸汽灭菌法（高压灭菌锅）c、辐射d、过滤e、化学方法5、微生物检验的意义a、它是衡量食品卫生质量的重要指标。b、通过食品微生物检验，可以判断食品加工环境及食品卫生环境，能够对食品被细菌污染的程度作出正确的评价。c、食品微生物检验是以贯彻“预防为主”的卫生方针。6、微生物检验的对象菌落总数大肠菌群各种曲霉的菌落青霉的菌落•啤酒酵母的菌落•红酵母的菌落•各种酵母菌的菌落7、微生物检验的质量管理一)内部质量控制a.为保证实验室连续评价结果的可靠性和精密度，必须对所用方法的重复性及再现性定期测定b.对于不同的控制系统，实验室必须建立限值，超过限值应采取纠偏措施。实践中内部质量控制可包括：(1)系统地使用一式双份的菌落计数测定；(2)由同一检验人员和几个检验人员作平行样；(3)定期或不定期进行盲样测试。（二)外部质量控制a.实验室应参加外部的质量控制活动,对其开展的每一项检测均应参加相应的室间质量控制。b.对有关实验室或管理机构发出的测试样品应严格地当作普通样品一样处理,这样一种方法有助于实验室每天测试的准确性和重复性,是对实验室所用的方法,试剂,设备,人员能力的测试。C.从室间样品测试中的错误可以发现实验室的不足之处,对工作人员的教育改进可以提高实验室的检测质量。d.对返回的室间测定评级中存在的问题应当召集体员工讨论,改进措施(包括方法的改变,员工的改变,员工的再训练,培养基和试剂购买来源的更换等)应当记录在案。e.某些项目缺少室间质量控制,实验室可以设置室内质量控制,每半年自行评估一次。f.经常参加微生物实验室间质控活动,有助于加强检测人员的基本功训练,增强样品检测过程中“量”的概念。g.实验室间的质控可在国内外范围进行,有能力的实验室应力争参加国家际间质控活动,树立良好的检验信誉。8、微生物检验的发展趋势近年来，随着分子生物学和微电子技术的飞速发展，快速、准确、特异检验微生物的新技术、新方法不断涌现，微生物检验技术由培养水平向分子水平迈进，并向仪器化、自动化、标准化方向发展，提高了食品微生物检验工作的高效性、准确性和可靠性。1.电阻抗法电阻抗法是近年发展起来的一项生物学技术，已经开始应用于食品微生物的检验。其原理是细菌在培养基内生长繁殖的过程中，将会使培养基中的大分子电惰性物质如碳水化合物、蛋白质和脂类等，代谢为具有电活性的小分子物质，如乳酸盐、醋酸盐等，这些离子态物质能增加培养基的导电性，使培养基的阻抗发生变化，通过检测培养基的电阻抗变化情况，判定细菌在培养基中的生长繁殖特性，即可检测出相应的细菌。该法目前已经用于细菌总数、霉菌、酵母菌、大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等的检测。2.快速酶触反应及代谢产物的检测快速酶触反应是根据细菌在生长繁殖过程中可合成和释放某些特异性的酶，根据酶的特性，选用相应的底物和指示剂，反应的测定结果有助于细菌快速诊断。如美国3MPetfifilmTM微生物测试片可分别快速测定细菌总数、霉菌、酵母菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠菌群等。3.微量生化法Bachman和Weaver在20世纪40年代后期首先开创了微量生化法。至今，市售的微生物鉴定用试剂盒有多种，常见的有MICRO-ID、API等。API由20个含干燥培养基的微管组成，其中的培养基用于进行酶促反应或糖发酵试验。检验时将预处理的菌悬液加入微管中培养后观察颜色变化，并纪录，输入APILABPlus软件得出结果。API创建了独特的数值鉴定法，可鉴定15个系列、600多个细菌种。因此，该方法具有简单、快速、可靠等特点。第二讲:微生物的形态结构与生理特性微生物非细胞生物细胞生物病毒原核生物真核生物细菌酵母菌、霉菌1、细菌细菌是一种具有细胞壁的单细胞生物.细菌的大小以微米（μm）为测量单位（一微米等于千分之一毫米）。根据细菌形态一般分为球菌、杆菌、螺旋菌三大类。细菌具有细胞壁、细胞膜、细胞质、细胞核、核糖体和内含物等基本结构。细菌的特殊结构有荚膜、鞭毛、菌毛、芽孢等。大肠杆菌金黄色葡萄球菌2、酵母酵母菌（yeast）是一通俗名称，没有确切定义。一般认为酵母菌具有以下五个特点：个体一般以单细胞状态存在多数出芽繁殖，也有的裂殖能发酵糖类产能细胞壁常含有甘露聚糖喜在含糖量较高、酸度较大的环境中生长酸度较大的环境中生长种类较多，目前已知100多个属，有700多种。分布广，在水果、蔬菜、花蜜和植物叶子表面以及果园的土壤里。在牛奶、动物的排泄物以及空气中也有酵母存在。大多数腐生，少数寄生。与人类关系密切酵母菌是人类应用比较早的微生物。在食品方面——酿酒、制作面包、生产调味品等。在医药方面——生产酵母片、核糖核酸、核黄素、细胞色素C、B族维生素、乳糖酶、脂肪酶、氨基酸等。在化工方面——使石油脱腊、以石油为原料生产柠檬酸等。在农业方面——生产饲料（例如单细胞蛋白SCP）。在生物工程方面——作为基因工程的受体菌。3、霉菌指凡是在基质上长成绒毛状、棉絮状或蜘蛛网状的丝状真菌，其菌丝体比较发达而又不产生大型子实体。•霉菌的菌落特征：•液体培养时的特征：如果是静止培养，菌丝往往在液体表面生长，液面上形成菌膜。如果是震荡培养，菌丝可相互缠绕在一起形成菌丝球，亦可形成絮片状，与震荡震荡速度有关。•菌落特征霉菌的菌落大、疏松、干燥、不透明，多呈绒毛状、絮状或网状等，菌体可沿培养基表面蔓延生长，由于不同的真菌孢子含有不同的色素，所以菌落可呈红、黄、绿、青绿、青灰、黑、白、灰等多种颜色。•常见的霉菌：Aspergillusflavus（黄曲霉）Asp.niger（黑曲霉）Mucormucedo（高大毛霉）Rhizopusoryzae（米根霉）Pencillinmchrysogenum（产黄曲霉）Neurosporacrassa（粗糙镰孢霉）Trichodermaviride（绿色木霉）土曲霉的菌落黑根霉的菌落青霉的菌落黑曲霉的菌落5、病毒•病毒的结构十分简单，没有细胞结构，只有蛋白质外壳和内部的遗传物质。123445病毒不能独立生活，必须寄生在其他生物的细胞内。一旦离开活细胞，病毒的生命活动就会停止。6、微生物的营养微生物同其他生物一样都是具有生命的，微生物细胞直接同生活环境接触并不停地从外界环境吸收适当的营养物质，在细胞内合成新的细胞物质和贮藏物质，并储存能量，微生物从环境中吸收营养物质并加以利用的过程即称为微生物的营养（nutrition）。营养物质是微生物构成菌体细胞的基本原料，也是获得能量以及维持其它代谢机能必须的物质基础。微生物吸收何种营养物质取决于微生物细胞的化学组成。有机元素(占干物质中的%)微生物种类CNHO细菌/Bacteria酵母/Yeast霉菌/Mold5049.847.91512.45.286.76.72031.140.2分析微生物细胞的化学成分，发现微生物细胞与其他生物细胞的化学组成并没有本质上的差异。7、微生物的生长1.个体生长很不明显，持续很短时间就繁殖。2.在实际的工作中，常以微生物的群体为单位来研究微生物的生长。调整期对数期衰亡期时间细胞数目的对数稳定期温度A：微生物生长最旺盛时的温度叫最适生长温度B：绝大多数微生物最适生长温度为25℃--37℃C：最适温度范围内，微生物的生长速率随温度上升而加快；超过最适生长温度后，微生物的生长速率急剧下降D：依据最适生长温度，可将微生物分为低温型、高温型、中温型。氧依据对氧的需求，微生物分为好氧型微生物（多数细菌、大多数真菌）；厌氧型微生物（某些链球菌、某些产甲烷杆菌）；兼性厌氧型微生物（酵母菌）PHA：每种微生物的最适PH不同B：多数细菌最适PH是6.5—7.5；真菌5.0—6.0；放线菌7.5—8.5。C：超过最适PH，影响酶活性、细胞膜稳定性等7、微生物