微生物菌种高通量筛选技术及装置-储炬

华东理工大学国家生化工程技术研究中心(上海)储炬2013-3-24，上海微生物菌种高通量筛选技术及装置研究全国发酵工程技术与工艺装备科技创新与产业化发展交流研讨会内容提纲高通量筛选在微生物育种中的重要意义菌种高通量筛选技术国际进展国家生化工程中心高通量筛选工作基础一、高通量筛选在微生物育种中的重要意义1、菌种是发酵技术的源头2、菌种是发酵技术的核心之核心3、菌种提高不增加设备材料投入1、菌种发酵水平是企业产品市场竞争力的体现之一2、育种工作中两大任务：突变与筛选一、高通量筛选在微生物育种中的重要意义变异菌种库筛选目标株自然选育人工诱变推理选育杂交育种基因工程代谢工程各种组学系统生物学合成生物学特异性模型筛选量突变仅是前提筛选才是关键3、我国菌种筛选技术和装备现状与国际菌种筛选技术存在相当大差距我国：传统方法，筛选模式式半个世纪没有明显改进国际：高通量筛选技术(Highthroughputscreening,HTS)一、高通量筛选在微生物育种中的重要意义TraditionalscreeningHighthroughputscreeningFlask/tube(single)Microtiterplate(12、24、48、96、384、1536)Volume(10-50ml)Volume(10-500ul)Screen20-50/week/labScreen1000-10000/week/labManualAutomaticLaboriousLaborsavingSeriesParallel内容提纲高通量筛选在微生物育种中的重要意义菌种高通量筛选技术国际进展国家生化工程中心高通量筛选工作基础高通量筛选装置1微孔板式反应器2微流控式芯片实验室3摇瓶形式的微型反应器123¾微生物菌种筛选一般流程二、菌种高通量筛选技术国际进展出发株诱变等10倍稀释涂平板单菌落初筛复筛工艺放大接种倒平板培养基保藏活化前处理检测¾微生物菌种筛选手段的发展趋势：自动化微型化高通量‹培养基灭菌、倒平板、挑取单菌落、分装发酵培养基、接种、培养、抽提、参数分析和数据自动收集处理等过程‹单元自动化与系统集成自动化二、菌种高通量筛选技术国际进展自动化微型化高通量出发株诱变等10倍稀释涂平板单菌落初筛复筛工艺放大接种倒平板培养基保藏活化前处理检测全自动培养基分装系统750皿/h自动灭菌培养基制备机出发株诱变等10倍稀释涂平板单菌落初筛复筛工艺放大接种倒平板培养基保藏活化前处理检测FillingUnit分装速率：400-1200dishes/hr分装量：4-45ml/0.5-0.6sec平动规格：直径92-98mm可调高度15-21mm可调灭菌方式：253.7nm紫外线灭菌尺寸重量：45cm(L)*30cm(D)*61cm(H),15kg★StackingUnit堆叠速率：可调，与输送机自动配合。堆叠高度：2-15板平皿，可调堆叠桌面：500´500mm可扩充尺寸重量：81cm(L)*49cm(D)*45cm(H),13kg出发株诱变等10倍稀释涂平板单菌落初筛复筛工艺放大接种倒平板培养基保藏活化前处理检测自动细菌平板稀释仪出发株诱变等10倍稀释涂平板单菌落初筛复筛工艺放大接种倒平板培养基保藏活化前处理检测挑4600个克隆/小时培养出发株诱变等10倍稀释涂平板单菌落初筛复筛工艺放大接种倒平板培养基保藏活化前处理检测出发株诱变等10倍稀释涂平板单菌落初筛复筛工艺放大接种倒平板培养基保藏活化前处理检测培养基分装传统方法出发株诱变等10倍稀释涂平板单菌落初筛复筛工艺放大接种倒平板培养基保藏活化前处理检测高通量方法（96、384、1536）/min传统方法1-2/min1/15-30min二、菌种高通量筛选技术国际进展出发株诱变等10倍稀释涂平板单菌落初筛复筛工艺放大接种倒平板培养基保藏活化前处理检测培养基分装二、菌种高通量筛选技术国际进展2056valves,256compartmentscontainingbacterialexpressinganenzyme24个，5ml12个，30ml24个，1ml在线多参数测量微反应器过程参数检测（重复性）二、菌种高通量筛选技术国际进展左图4.9×2.3×2.2m，整个箱体有温湿度控制，箱体内，条形码阅读器、盖板站、封板器、液体处理装置、摇床、光度计、离心机、冷藏室等。平行地实现样品准备、运行、监控768个（16个48孔板）。系统集成自动化二、菌种高通量筛选技术国际进展¾1929，1940s-1950s¾Pfizer公司：土霉素的发现‡56名科学家、10万份土样、历时1年‡25%市场¾1984年，Pfizer提出AutomationProject.¾1990年，在Nagoya,Japan实施‡1万株份/周高通量筛选技术的起源及应用我国菌种筛选技术和装备现状与国际菌种筛选技术存在相当大差距青霉素：5万——12万（国内）8万——20万（国外）红霉素：5000——8000/10000(国内)10000——15000（国外）阿维菌素：4000——8400（国内）10000以上（国外）案例高通量筛选投入自动化程度高、功能、进口设备500万元-5000万元高通量是相对概念结合国情，逐步推进，手动到自动50万元-500万元二、菌种高通量筛选技术国际进展内容提纲高通量筛选在微生物育种中的重要意义菌种高通量筛选技术国际进展国家生化工程中心(上海)的高通量筛选工作基础三、国家生化工程中心(上海)的高通量筛选工作基础ScaleupScaledown微型化高通量标准化多尺度菌种表型研究对高通量筛选技术存在认识上的误区仅注重培养环节高通量，忽略其他步骤匹配和瓶颈的转移问题认为微型化只要按比例缩小即可，忽略参数相关性问题对操作条件的平行性没有足够的认识对标准化重于昀优化的认识不足高通量筛选是提高成功几率的一种技术手段菌种高通量筛选技术高通量前处理技术高通量培养技术高通量液体处理技术高通量转接种技术高通量克隆制备技术菌种库管理技术高通量数据管理技术高通量分析检测技术菌种高通量筛选技术技术路线组成分析测试高通量培养菌种资源菌种高通量筛选技术通量匹配限制瓶颈在不断克服和转移菌种高通量筛选技术)菌种高通量筛选技术是一整套高通量技术的有机整合和合理匹配三、国家生化工程中心的高通量筛选工作基础流场特性OTR与混合三、国家生化工程中心的高通量筛选工作基础三、国家生化工程中心的高通量筛选工作基础以高耗氧长周期培养微生物为研究对象，研究微型化培养中技术问题（头孢菌素C,红霉素生产菌）三、国家生化工程中心的高通量筛选工作基础高通量微型化标准化目标：全自动专用装置和技术路线开发近期：以手动/半自动方式、低成本技术路线，为自动化技术作准备培养培养高通量（微型化）培养技术前处理前处理高通量（微型化）样品处理方法效价分析效价分析高通量（微型化）产物分析方法生理参数生理参数分析分析高通量（微型化）过程生理参数分析三、国家生化工程中心的高通量筛选工作基础1、丝状、高耗氧微生物HTS培养技术单次筛选通量从160株提高到昀大12288株的高通量培养装置改造三、国家生化工程中心的高通量筛选工作基础微孔板固定架板数：板数：88××88××22＝＝128128孔数：孔数：128128××2424＝＝30723072128128××4848＝＝61446144128128××9696＝＝1228812288三、国家生化工程中心的高通量筛选工作基础高通量培养技术装液量：装液量：500500——20002000ulul2424孔孔4848孔孔9696孔孔固体培养和菌种保藏三、国家生化工程中心的高通量筛选工作基础可灭菌、重复使用寿命长、成本低、易清洗、能统一标准、防交叉污染、透气性好、防止水分蒸发孔板盖三、国家生化工程中心的高通量筛选工作基础简易接种装置和无菌板盖主要解决了微型化培养中的如下问题„供氧„蒸发„无菌„混合„装量三、国家生化工程中心的高通量筛选工作基础供氧能力分析：KLa测定500mL500mL24孔板48孔板96孔板time1112111728Klah-125.323.125．316.39.9比较比较2424、、4848、、9696孔培养孔培养板和板和500ml500ml三角瓶的三角瓶的供氧能力供氧能力微孔几何构造与KLa的关系44.555.566.577.588.5135791113151719212325Time(h)pH24孔板500ml三角瓶500ml三角瓶48孔板96孔板三、国家生化工程中心的高通量筛选工作基础48孔板，培养四天后，不同孔径盖子与培养基蒸发关系2mm3mm4mm123456A1.1441.07821.06291.08451.02391.0094B1.23921.23551.25411.28391.05771.0494C1.26941.25421.26471.25151.07151.0340D1.25311.32131.25771.19121.07821.0589E1.27341.30731.25071.26951.04681.0515F1.25671.23021.25831.24451.07941.0307G1.26181.24711.27181.25521.03510.9434H1.19851.18091.15781.19590.93610.8578蒸发量13%13%14.6%14.3%27%28.6%对比：50/500ml摇瓶,6天后蒸发量:平均:13.4%,范围:10.3-16.2%结论：采用孔径为2mm的孔板盖可以达到允许的蒸发要求蒸发与交叉污染问题三、国家生化工程中心的高通量筛选工作基础高通量（微型化）过程生理参数分析总糖02468101212345天数总糖值microplateflask还原糖00.511.522.512345天数值microplateflask氮02040608010012014012345天数值microplateflask效价0500100015002000250017C1C7菌株值摇瓶圆柱小瓶12孔板三、国家生化工程中心的高通量筛选工作基础2、微型化样品前处理固液分离萃取脱水反应专用深孔板专用深孔板离心机离心机三、国家生化工程中心的高通量筛选工作基础多通道可调深孔板取样适配器三、国家生化工程中心的高通量筛选工作基础5、带在线传感器微型反应器研制5.56.06.57.07.58.08.5100200300400500600700800ODpHFig.3LinearFitofDatafromMPN4053、高通量（微型化）抗生素效价分析方法生物效价高通量分析方法建立基于比浊法原理设计生物效价高通量分析方法，使分析时间从20多小时缩短到4小时，分析样品量从1ml降到10ul，鉴定菌培养基从30ml降到90ul，一次检测样品数量可达到成百上千份，而且仅需1人操作，传统生物效价分析，每天每人分析样品数量50份左右。&化学效价高通量分析路线开发了可以与自动化液体处理工作站相匹配的微量化化学分析路线，筛选通量更高，样品检测体积更小，反应体积从20ml降到500ul，检测体积从5ml降到100ul，分析时间更短，1小时之内完成上千份样品分析。&三、国家生化工程中心的高通量筛选工作基础左图：比较采用不同效价分析方法，测定同一菌株，一个发酵周期内过程效价值¡常规管碟法„常规化学法S常规比浊法¯高通量微型化分析方法右图：比较不同菌株，不同分析方法检测效价结果。1：管碟法；2：化学法；3：比浊法；4：微型化方法菌株编号：A：A9；B：A4；C：A47；D：E3；E：A35；F：E1例子:红霉素效价分析三、国家生化工程中心的高通量筛选工作基础检测结果相关性很好比较微型化化学效价分析和常规化学效价分析结果反应体积10ml5ml2.5ml1250μl500μl200μl吸光度0.1870,1920.1840.1800.1790.174化学效价496750754902481647944686相对标准偏差0.0282两种化学效价分析方法平行性01000