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1第五章有机溶剂中的酶催化反应2第一节非水介质中酶学基础•用于酶催化的非水介质包括：–含微量水的有机溶剂–与水混溶的有机溶剂和水形成的均一体系–水与有机溶剂形成的两相或多相体系–胶束与反胶束体系–超临界流体–气相34非水介质中酶的结构5有机介质中的酶促反应的优越性原先的认识：1）我们以前的酶学理论知道，酶溶解在水溶液中，而且酶一定是在水溶液中才能反应，又知道水是个极性分子，酶只能在极性溶剂中反应。2）我们又知道有机溶剂是酶的变性剂，用了以后，应该在尽可能短的时间内去除有机溶剂，再把酶溶解于水中，以防止酶的变性和失活。现在酶工程技术的发展，已经告诉我们，酶反应可在有机介质中进行，已经成为酶工程、酶化工研究的一个新的领域，开辟了一个新的研究方向。6有机介质中酶促反应优越性被认为至少有以下优点：1）有利于疏水性底物反应2）提高酶反应T，加速反应V，提高酶反应稳定性。3）可以催化一些在水相中不能进行的反应。4）可以改变反应的平衡方向。5）控制底物的专一性。6）防止由水引起的付反应。7）扩大反应的pH范围.8）有利于酶的固定化。9）酶、产物容易回收。10）消除底物、产物的抑制作用。11）防止微生物的污染。7第二节反应条件：一句话，条件要适宜,在一个特定条件下进行，。一、保证必需水含量水是保证酶催化反应的必需条件，活性构象是水分子直接或间接由氢键等非共价键相互作用来维持。因此与酶分子紧密结合的一单层水分子对催化作用非常重要。而其他的水则相对不那么重要(即由有机介质替代的那部分水不那么重要了）。8必需水：是维系酶构象稳定和酶催化活性所必需的那部分最少量的水分子,有时也叫结合水,或者束缚水。只要那部分必需水不丢失,其他的大部分水可以由有机溶剂代替.所以，有机介质中的酶促反应在微观上看是水的酶反应，但是在宏观上看是有机介质中的酶反应。如有的酶反应即使水只占0.015%，酶仍然有活性，可以进行酶反应,而且反应速度非常快。9下面是一个胰脂肪酶的反应速度---水含量的关系图。10一般认为，一个酶结合水的过程分4步：1.首先与酶分子表面的带电基团结合一部分水(0-0.07g/g(水/酶))。2.再与酶分子表面的极性基团结合一部分水(0.07-0.25g/g(水/酶))。3.再聚集到表面相互作用较弱的部位(0.25-0.38g/g(水/酶))。4.最后酶分子表面完全水合化，水分子覆盖酶分子表面。11二、必需水含量问题：一般因酶分子本身,或溶剂系统不同而有所不同。如脂肪酶有几个水分子,胰凝乳蛋白酶几十个水分子,乙醇脱氢酶、多酚氧化酶有几百个水分子。另外同一个酶在不同溶剂系统中含水也不同。如胰凝乳蛋白酶，在甲苯中，含水0.5%；氯仿等系统中，含水1.0%，酶活性最高。一般酶要发挥它的催化活性，必须与有机溶剂系统获得水分以维持酶必要的水合状态。12三、酶种类的选择酶选择原则：在有机介质中酶有不变性的潜在能力，即能保持酶催化活性的构象和催化能力。由于酶的组成、结构、构象多样化，所以不能认为所有的酶都可以在有机介质中反应。但是，一般现在的资料显示认为大多数酶可以做到。而有些酶在有机介质中可以进行，在水中却不能反应，如脂肪酶、蛋白酶、次黄嘌呤氧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶、醛缩酶、多酚氧化酶、醇脱氢酶、细胞色素氧化酶、ATP酶，胆固醇氧化酶等。这些酶有些属膜酶，在水溶液中反而不稳定。13酶是否适于在有机介质中反应，除与酶性质有关外，还取决于酶-底物、产物-溶剂间的关系问题。这完全需要用实验来决定。14四、酶形式的差别酶在有机介质中的溶解特性、稳定性、活性等，对酶的选择很重要。1）酶00000000粉将酶做成冻干粉，然后在有机介质中充分搅拌，超声波处理，使得颗粒变小，悬浮于介质中。2）控制酶量的问题需要适量。如α-凝乳蛋白酶在乙醇中的转脂反应，随着加酶量的下降，活性反而上升，速度快。可能理由：被认为在水含量不变的情况下，酶少到一个合适的浓度，可以使酶聚合体变小，反而增大了酶-底物接触的面，减少了底物扩散的限制，酶反应速度反而加快。153）酶化学修饰的问题化学修饰可以改变酶的一些理化性质，有利于酶在有机溶剂中的稳定性，原先不稳定的酶经过修饰变得稳定，主要是因为改变了酶的一些理化性质。一般认为大多数酶可以在有机介质中反应。但是，操作稳定性差。化学修饰的目的就是要提高酶的稳定性。16化学修饰方法很多，聚乙二醇（PEG）修饰较常见。如PEG修饰过氧化氢酶，然后在有机介质中活性显著提高。还研制了磁性脂肪酶（磁性颗粒外包PEG修饰的脂肪酶），它在有机介质中较稳定，活力也较高，且可在磁场中回收。还有用谷氨酸、十二醇、葡萄糖酸内酯合成了糖脂后修饰超氧化物歧化酶（SOD）。所得的这种SOD糖脂复合物变成脂溶性的酶，而不是水不溶性的。SOD糖脂复合物在有机介质中活性高大大高于在水中的活性，并且它对温度、pH、蛋白酶水解等的稳定性均高于天然SOD。17还有用聚磷酸酯、脂肪酸等修饰SOD，同样得到了适合于有机介质中进行催化反应的化学修饰酶--SOD。在进行了不同化学修饰酶在有机介质中的反应的研究以后，发现化学修饰（采用脱糖基化、PEG修饰等）能够增加酶的表面疏水性，而疏水性的增加正是提高酶在有机介质中的溶解性和活力的重要原因。PEG修饰酶在甲苯中的活性比未修饰酶高16倍。通过酶蛋白甲基化作用或疏水分子对酶蛋白的修饰，均可提高酶在有机介质中的溶解性、稳定性和活性。184）固定化酶第二章已经讲到固定化酶和细胞的问题，固定化有许多好处。在有机溶剂中进行酶反应，如果进行酶的固定化，必定可以充分显示其优越性。酶被吸附或者固定在固相载体（水不溶性）上，就可以对抗有机介质对酶的变性能力，提高反应的速度和对热的敏感性。一般象用硅胶、硅藻土、玻璃珠等制成固定化酶，载体通过分配效应剧烈地改变酶所处的微环境中底物和产物的局部浓度。固定化后，首先使载体能通过分配效应改变酶所处微环境中底物和产物的局部浓度。19例子：在水溶液中，底物肉桂醇浓度在0.1mmol/L以上可强烈抑制马肝醇脱氢酶活性。现在它在乙酸丁酯中使用亲水载体固定化酶，底物浓度高达50mmol/L也不会发生抑制作用。还有个例子：研究几种不同载体的固定化脂肪酶时发现，疏水性琼脂珠载体的固定化效果最好。固定化后脂肪酶在有机介质中的活性比对应酶粉高46.5％。由于载体上疏水基团的存在，使疏水性底物在疏水作用下分配到载体周围的浓度高于反应介质中的浓度。使酶反应速度提高。20其次，载体影响酶分子上的结合水。亲水性高的载体会从溶剂和酶分子中夺取大量的水，造成酶部分失水而降低酶的活性；亲水性低的载体不足以夺取酶的必需水，能保持它的高酶活性。还有通过载体与酶之间形成的多点的结合作用，可稳定酶的催化活性构象。例如，α-胰凝乳蛋白酶与聚丙烯酰胺凝胶共价结合后，在乙醇中的稳定性明显提高，并且对有机溶剂的抗性随酶与载体间共价键数量的增加而增强。2122另外载体问题还会影响酶的动力学。如影响一个酶同时催化两个反应的相对速度。在低水活度下把胰凝乳蛋白酶固定在聚酰胺载体AccureIPA6上，水解反应被抑制，却有利于醇解反应进行。这是固定化后发生的另外一种情况。一般来说，载体要选择疏水性基质，目的是为了有利于在有机溶剂中反应。如用具有高氧渗透性的硅聚合物比较好。用固定化材料，还应考虑载体的酶负载量、颗粒大小、表面积、内部孔径大小、酶与载体间的相互作用等。这与前面固定化时讲的要求，出发点不一样。23五、溶剂的选择1.水溶性有机溶剂甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、甘油、正丁醇等2.水不溶性有机溶剂石油醚、三氯乙烷、乙酸乙酯、苯、己烷等在这些酶反应溶剂的选择中，介质的组成一般可有四种：1）单相共溶剂系统（水与能与水相溶的有机溶剂）2）双相溶剂系统（水与跟水不相溶的有机溶剂）3）低水有机系统4）反向微团系统242526在上面四种系统中，1---3用的多原因是：1）因为这几个系统容易建立2）产物和酶容易回收其中又以低水有机系统为好，因为适合疏水的有机溶剂和耐高温（增加稳定性）。缺点：扩散差，所以反应速度慢等。克服的方法：选用反向微团系统。2728那么，有机溶剂最终是如何影响酶反应的？一般解释有如下几种：1）通过底物、产物在水相和有机溶剂中分配，必然影响到底物、产物在酶必需水在水层中的浓度，这样，自然影响到酶的反应速度。2）必需水对特定的酶是一定的。如果有机溶剂与酶的必需水作用，夺取酶的必需水，一定影响酶的活性。如果是极性强的有机溶剂，夺取酶的必需水就多，酶就可能最终失活。如果是一般的有机溶剂，夺取酶的必需水不明显，就最适合酶在这类有机溶剂中反应。29有一个例子十分明显。胰凝乳蛋白酶，在辛烷中的反应速度比吡啶中快104倍。酶活性随着疏水性增加而增加。3）有机溶剂本身的影响。(1)有机溶剂使底物基态能级下降或使酶-底物复合物能级升高，从而增大酶反应的活化能来降低酶反应速度；(2)有机溶剂分子进入酶活性中心，降低活性中心内部极性并加强底物与酶之间形成的氢键，使酶活性下降；(3)有机溶剂侵人会造成酶的三级结构变化，间接改变酶活性中心结构来影响酶活性。30正由于以上原因，正确选择有机溶剂显得十分重要。所以必须考虑以下几种因素：（1）溶剂与反应的相容性。例如，酶催化糖修饰反应，必须在亲水性的有机溶剂（加二甲基甲酰胺等）中进行。若使用疏水性有机溶剂，底物不溶解，酶促反应不能发生。（2）溶剂对主要的反应应该是惰性的。（3）溶剂的密度、粘度、表面张力、毒性、废物的处理和成本等。但是普遍认为最佳溶剂因底物而异。即一种溶剂在辛醇／水两相间分配系数的常用对数值(lgP)。P大，酶活性大，所需要的水量少。31后来又有用临界流体反应体系，在产物中不留下任何溶剂。即在临界温度、临界压力下反应。如用CO2作介质，进行多酚氧化酶的催化反应，反应后CO2全部从反应体系中自然去除。还有用超临界CO2作介质，进行脂肪酶的催化反应，可以把压力提高到适当的数值，使转酯反应大大加快。3233图中表示了与气相、液相、固相区相对应的超临界流体区图中直线表示以CO2的密度为第三参数的Tp关系。CO2密度随压力与温度的增减而产生较大的变化。如温度为37℃时，压力由7.2MPa（p＝0.21g/cm3）上升到10.3Mpa（p=0.59g/cm3），密度增加了2.8倍。当压力为10.3MPa时，温度由92℃下降到37℃，也可发生相应的密度变化。在临界区的附近，压力和温度的微小变化，引起流体的密度大幅度的变化。34六、pH的选择问题：因为在有机介质中的最适pH与水溶液中的最适pH的酶反应是一样的，所以在进行酶的冻干时，可以在最适pH的缓冲液中冻干出来，再进行有机系统的反应。这样，可以使酶在有机溶剂中反应的微环境具有溶液酶的最适pH环境。35第三节有机介质对酶反应的影响总起来讲基本上遵循米氏方程的动力学。但也有一些影响。36一、酶的稳定性问题1）一般被认为酶更加稳定，因为对热的稳定性提高。如猪胰脂肪酶在醇和酯中进行反应，100℃温度下反应,半衰期12小时以上,活性比25℃时高好几倍。胰凝乳蛋白酶在60℃水中，几分钟就会有失活。而在辛烷中，半衰期有几个小时。2）存储酶的存储稳定性提高胰凝乳蛋白酶20℃的水中，半衰期只有几天。而在辛烷中，半衰期有6个月，活性全部不损失。37二、活性a)单相共溶剂系统中对酶的影响作用主要是如下：1)有机溶剂直接作用于酶，破坏维持酶活性构象的氢键、疏水键、水化层，酶变性失活。一般有随着有机溶剂浓度上升,活性下降的一般规律。2)但有些酶，有机溶剂的浓度上升，酶活性反而上升，到一定浓度，酶活性达最高，如再提高浓度，酶活性反而下降。如胰蛋白酶在1,4-丁二醇中最适浓度80%猪心线粒体ATPase，在乙醇中最适浓度10%EcoRI内切酶在甘油中最适浓度为20%38b)低水有机系统：有些酶反应会发生变化，如沉淀在玻璃球上的胆固醇氧化酶在有机溶剂中测定胆固醇，速度只是水中的10—25%。又如酵母醇脱氢酶在1%的水和醋酸丁酯中反应，酶活性是水中的1-60%左右。总之，酶活性随着水活度的大小而不同，而水活度一定，酶活性会随着载体不