PFGE(脉冲场凝胶电泳)-标准操作规程(SOP)

PFGE（脉冲场凝胶电泳）标准操作规程(SOP)关键词：PFGE，脉冲场凝胶电泳目的：运用PFGE方法对20Kb至数Mb的DNA进行分子分型图谱分析：采用“PFGE脉冲场凝胶电泳分子分型识别系统”（官微：PFGE_CHINA）进行图谱分析。系统主要功能是PFGE图谱分子分型在线识别和处理，提供二叉层级聚树，MLVA、MLST字符类型的最小生成树，SEQUENCE基因片段类型的亲缘树计算和图形绘制，用于分析菌株之间的相关性，协助追踪感染来源以及有效控制疫情。第一天一、胶块的制备1、在Falcon2054管上标记样品名称和空白对照，分别加入约2ml细胞悬浊液（CSB）；2、在1.5mleppendorf管上标记好对应样品的名称；3、在模具上标记好对应样品的名称；4、用CSB湿润接种环，从培养皿上刮取适量细菌，均匀悬浊于CSB中，用bioMerieuxVitekcolorimeter测其OD值，并调整至3.6~4.5。如果OD值大于4.5，加入CSB稀释；如果OD值小于3.6，增加菌量提高其浓度。5、取400µl细菌悬浊液于相应的1.5mleppendorf管中，置于37℃水浴中孵育5分钟。将剩余的细菌悬浊液置于冰上直到胶块制备好放在水浴摇床中。6、从水浴箱中取出eppendorf管，每管加入20µl蛋白酶K（储存液浓度为20mg/ml）混匀，使其终浓度为0.5mg/ml。7、制备好1%SeakemGold：1%SDS，放于56℃水浴箱中。8、在eppendorf管中加入400µl的1%SeakemGold：1%SDS，用枪头轻轻混匀。9、将混合物加入模具，避免气泡产生，在室温下凝固10-15分钟。注意事项：（1）用后的接种环要放在指定的废弃物容器中。（2）细胞悬浊液、蛋白酶K要置于冰上。（3）在混合细胞悬浊液和1%SeakemGold：1%SDS时要避免气泡的产生。（4）混合物加入模具时不能产生气泡。（5）在加1%SeakemGold：1%SDS的过程中1%SeakemGold：1%SDS要一直放在56℃水浴箱中。二、细胞的裂解1、在50ml的screw-captube上做好标记。2、配制细胞裂解液（CLB）：每5ml细胞裂解液加入25µl蛋白酶K（20mg/ml），使其终浓度为0.1mg/ml，然后颠倒混匀。注意：蛋白酶K要置于冰上，配制好的细胞CLB也要置于冰上。3、每个管子加入5ml蛋白酶K/CLB混合液。4、如果想使胶块平齐，可以用刀片削去模具表面多余的部分。（1）可重复利用的模具：打开模具，用小铲的宽头部分将胶块移入相应的screw-cap管中。（2）一次性模具：撕掉模具下面的胶带，用小铲将胶块捅进相应的screw-cap管中，将模具、胶带、小铲放入废弃物容器中。5、保证胶块在液面下而不在管壁上。6、将管子放在54℃水浴摇床中孵育2小时，转速约170转/分钟。7、将纯水和TE放在50℃水浴摇床中预热。三、洗胶块1、从水浴摇床中拿出screw-cap管，盖上绿色的screened-cap。轻轻倒掉CLB。在实验台上轻磕管底使胶块落在管底。注意：把管倒置在吸水纸上，使管内液体被尽量排除干净。随后的操作中也如此。2、每管中加入15ml预热的纯水。3、确保胶块在液面下而不在管壁或盖子上，放回50℃水浴摇床中，摇10分钟。4、倒掉水，用纯水再洗一次。、5、倒掉水，加入15ml预热的TE，在50℃的水浴摇床中摇15分钟。6、倒掉TE，用TE重复洗三次，每次10－15分钟。7、倒掉TE，加入10mlTE，放在4℃冰箱保存备用。注意：要确保胶块在液面下而不在管壁或盖子上。四、胶块内DNA的酶切1、在1.5mleppendorf管上标记好相应的样品及H9812的名称。2、按照下面的比例配制缓冲液H的稀释液，混匀。试剂µl/胶块µl/10胶块纯水180µl1800µlBufferD20µl200µl总体积200µl2000µl注意：缓冲液要置于冰上。3、在每个1.5mleppendorf管中加入200µl缓冲液H的稀释液。4、小心从TE中取出胶块放在干净的培养皿上。5、用刀片切下2mm宽的胶块放入1.5mleppendorf管中。确保胶块在液面下面。将剩余的胶块放回原来的TE中。6、用同样的方法处理标准株H9812的胶块。7、将管子放在37℃水浴中孵育10-15分钟。8、在用稀释缓冲液孵育的过程中，按照以下的比例配制酶切缓冲液，混匀。试剂µl/胶块µl/10胶块纯水175µl1750µlBufferD20µl200µl酶（10U/µl）5µl50µl总体积200µl2000µl注意：（1）将酶置于冰上，用后立即放在－20℃保存。（2）用枪头吸出缓冲液H，避免损伤胶块。9、每管加入200µl混合液，轻轻在实验台上磕管子的底部，确保胶块在液面的下面。10、在37℃水浴中孵育至少2小时。五、加样（一）将胶块直接粘在梳子齿上1、调整梳子的高度，使梳子齿与胶槽的底面相接触。用水平仪调整胶槽使其水平。2、从37℃水浴中取出胶块，平衡到室温。3、用枪头吸出酶切混合液，避免损伤或吸出胶块。4、每管加入200µl0.5×TBE。5、把梳子平放在胶槽上，把胶块加在梳子齿上。如果用的是10个齿的梳子，把标准菌株H9812加在第1、5、10个齿上。6、用吸水纸的边缘吸去胶块附近多余的液体，在室温下风干约3分钟。7、把梳子放入胶槽，确保所有的胶块在一条线上，并且胶块与胶槽的底面相接触。从胶槽的下部中央缓慢到入100ml熔化的在55℃－60℃平衡的1％SKG。避免气泡的生成；如果有，用枪头消除。在室温下凝固30分钟左右。8、记录加样顺序。（二）将胶块直接加在加样孔内1、调整梳子的高度，使梳子齿与胶槽的底面有一定间距。用水平仪调整胶槽使其水平。2、把梳子放入胶槽，从胶槽的中央缓慢倒入100ml熔化的在55℃－60℃平衡的1％SKG。避免气泡的生成；如果有，用枪头消除。在室温下凝固30分钟左右。3、小心拔出梳子。4、从37℃水浴中取出胶块，平衡到室温。5、用枪头吸出酶切混合液，避免损伤或吸出胶块。6、每块胶加入200µl0.5×TBE平衡。7、用小铲将胶块加入加样孔。8、用溶化的胶封闭加样孔。注意：a)可以在加样孔中加入0.5×TBE，利用毛细作用将胶块沉在加样孔底，尽量避免气泡形成。b)记录加样顺序。六、电泳1、确保电泳槽是水平的。如果不水平，调整槽底部的旋钮。注意：不要触碰电极。2、加入2.2L0.5×TBE,关上盖子。3、打开主机和泵的开关，确保泵设在－70（这时缓冲液的流速约1L/分钟）和缓冲液在管道中正常循环。4、打开冷凝机，确保预设温度在14℃（缓冲液达到该温度通常需要20分钟左右）。5、打开胶槽的旋钮，取出凝固好的胶，用吸水纸清除胶四周和底面多余的胶，小心的把胶放入电泳槽，关上盖子。6、设置电泳参数。7、记录电泳初始电流（通常120－145ma）。8、结束电泳：关机顺序为：冷凝机－泵－主机。第二天七、图像的获取1、取出胶，放在盛放400mlEB溶液的托盘内（EB储存液浓度为10mg/ml，1：10,000稀释，即在400ml水中加入40µl储存液）。注意：EB是致畸剂。储存在棕色瓶中的EB稀释液可以用3-5次。废弃的EB溶液应妥善处理。2、将托盘放在摇床上摇25-30分钟。3、放掉电泳槽中的TBE，用1-2L纯水清洗电泳槽，并倒掉液体。4、戴上手套将用后的EB溶液小心倒入做有标记的棕色瓶中，在托盘中加入400-500ml纯水，放在摇床上脱色60-90分钟，如果可能每20-30分钟换一次纯水。5、用GelDoc2000拍摄图像。注意：如果背景干扰分析，可进一步脱色30-60分钟。6、转换成*.1sc文件用于处理分析。八、数据的分析图像的读取电泳图像通常用BIO-RAD的GELDOC2000或其它成像系统来获取。其它可以替代的成像设备，只要具有CCD相机，可以提供IBM兼容的未压缩的TIFF图像，且分辨力≥768x640像素，能够用BioNumericssoftware(AppliedMaths,Inc.)软件与PulseNet数据库中其它图像进行对比分析，也可以运用。运用GELDOC2000的简单说明：QUANTITYONE软件1、点击QUANTITYONE按钮打开该软件。2、点击菜单FILE→GELDOC。注意：需要10－20秒打开窗口。3、打开抽屉，把胶放在台板上。胶已经经过EB或GEL-STAR染色并经过充分脱色。用黑色胶框把胶放在合适的位置。关上抽屉门。图像的获取1、按下EPI-LIGHT按钮打开白光。2、把胶放在调准网格线内，使胶的加样孔和调准网格线的最上面一条蓝线对齐。3、保证调准网格线和过饱和按钮被选中。4、改变镜头的MIDDLERING以调整图像的大（顺时针）小（逆时针），使图像占据整个窗口。如果需要，挪动胶在台板上的位置。胶的加样孔、下边界和左右边界在屏幕上都应该可以看到。5、如果需要，按BOTTOMRING以调整相机的焦距。注意：焦距的调整只可以偶尔用之，不可用于每一块胶。可以用尺子帮助调整焦距。6、按下EPI-LIGHT关掉白光，按下UV按钮打开透射紫外光。7、点击AUTOEXPOSE以确定大概的曝光时间。当图像出现在窗口时，AUTOEXPOSE自动关闭而MANUALEXPOSE被激活。8、点击MANUALEXPOSE的↑↓按钮，调整曝光时间。而调整饱和度时，点击箭头或TURNTHETOPRING以降低光量（如果图像过饱和，图像显现红色）。注意：如果出现对话框“曝光可以在0.03－360秒之间波动”，则需通过改变相机的像素以调整饱和度。调整饱和度使样品条带没有红色很重要，因为这会影响BIONUMERICS软件对胶图像的分析。而胶加样孔的过饱和属于正常现象。9、当图像调整的比较满意时，按下FREEZE按钮停止曝光过程。按下UV按钮关掉紫外光（如果开门时UV灯打开，它会自动关闭）。图像的输出1、保存图像（*.1sc）：FILE→SAVE。确保选择正确的路径。文件默认的名字包括日期、时间和用户。可以改变文件名。2、打印文件：FILE→PRINT→VIDEOPRINT，也可以直接点击屏幕上的PRINT按钮。3、转为*.TIFF格式：FILE→EXPORTTOTIFFIMAGE→EXPORT，选择正确的路径。4、关闭QUANTITYONE程序：FILE→EXIT。5、取出胶放在染色盒内。用软麻布擦掉台板表面多余的液体，用水或70％的异丙醇洗干净。试剂储存液的配制1、1MTrisHCl,pH8.0*121.1gTrisbase溶于650-700ml纯水中，加入80ml6NHCl*，在室温下调pH至8.0，加水终体积至1000ml，高压灭菌。或者157.6gTris-HCl溶于800ml纯水中，在室温下调pH至8.0，加水终体积至1000ml，高压灭菌。2、10NNaOH*400gNaOH小心溶于800ml纯水中，冷却到室温，加灭菌的纯水使终体积至1000ml。3、0.5MEDTA,pH8.0*186.1gNa2EDTA2H2O溶于800ml纯水中，加入50ml10NNaOH调pH至8.0，加水终体积至1000ml，分成数份，高压灭菌。4、20%SodiumDodecylSulfate(SDS)*十二烷基硫酸钠－用于E.coliO157:H7,SalmonellaandShigellasonnei,PFGE将20克SDS小心加入装有80ml灭菌纯水的容器中，在35°-45°C轻轻混匀溶解，定容至100ml。5、20mg/ml蛋白酶K储存液*100mgProteinaseK粉末溶于5ml灭菌纯水中，混匀，分装在1.5ml离心管中，每管500-600μl，-20°C保存备用。6、10XTris-BorateEDTABuffer(TBE),pH8.3*0.9MTrisbase(108g)0.9MBoricAcid(55g)0.02MEDTA,pH8.0(40ml0.5M)溶于1000ml灭菌的纯水中，高压灭菌注意：如果缓冲液有沉淀生成必须丢