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疟原虫血片制作与染色云南省寄生虫病防治所赵晓涛电子邮箱：zxt_423@163.com办公室：疟疾防制科0879-2141182手机：18987921109QQ：35566625血膜制作血膜染色影响染色效果的因素主要内容血膜制作（血膜分类）用于检查疟原虫的血涂片有两种：一种是将血液涂呈薄膜状，称薄血膜；一种是血液涂成圆盘状，称厚血膜。厚血膜上的血细胞是重叠堆积在玻片上面，而薄血膜上的血细胞则要求平辅在玻片上面。门诊或现场发热病人血片标本片厚血膜用血量约为4μl～5μl,涂制成直径0.8～1cm的厚血膜,由于在制备过程中红细胞已溶解，疟原虫在形态上仍可分辨，但胞浆和胞核不可避免地形成一定程度的固缩。受影响较大的有大、裂殖体的形态。由于厚血膜与薄血膜相比血量大，须查范围小，节省时间，阳性检出率较高。厚血膜能查出疟原虫数是薄血膜的15～25倍。所以，我们推荐疟疾诊断（门诊检验及现场普查）应以检查厚血膜为主。厚、薄血膜的优缺点及其适用范围薄血膜用血量约为1-1.5μl，涂制成2cm宽×2.5cm长面积的薄血膜。由于在制备过程中，血片通常经甲醇固定，使红细胞及其内疟原虫的形态保持完整，适用于对疟原虫虫种的鉴定。由于用血量少，为保证检测的敏感性，常耗时较多，不适用于大规模调查。特别在医院的检验室，由于要求在短时间内作出诊断，因而极有可能出现漏诊。厚、薄血膜的优缺点及其适用范围血膜制作（取血时间）取血时机现症病人一般可随时取血，疟疾普查时可不考虑取血时机。但在诊断或需要某期疟原虫作标本时，则应掌握适宜的取血时机。血膜制作（取血时间）间日疟前驱期相当于肝内期疟原虫发育，因原虫密度太低，镜检多为阴性。发冷（寒战）期相当于红内期成熟裂殖体涨破红细胞期，镜检多为裂殖体和环状体。发热期外周血中以环状体（小滋养体）为主，也可见到裂殖体；出汗期因原虫密度太低，镜检多为阴性。发作后数小时，间歇期外周血中以大滋养体为主，形态较易辩认，为诊断的有利时机；发作36-48h，可检出裂殖体；发作1-2次后，配子体出现较多。血膜制作（取血时间）恶性疟较理想的取血时间是在发作后至20h内取血，发作后2小时左右，此时环状体发育至最高峰，初发患者退热后常查不到原虫。末梢血血检到恶性疟原虫配子体，是在末梢血出现环状体之后的7-10天。血膜制作（工具准备）一次性采血针、75%酒精、棉棒（球）,载玻片，推片，记号笔或铅笔。血膜制作（取血操作）取血方法采血部位一般人为耳垂，指头，通常在耳垂取血。先用75%酒精棉球消毒取血部位（冬季用手捻动耳垂使其充血后再行消毒），待酒精干后，用左手拇指和食指紧捏耳垂上方，右手持消毒采血针（一人一针，避免血传疾病）迅速刺入耳垂下端1~2毫米，不宜过深或过浅。然后用右手中指轻轻向上挤压出血。厚血膜用推片的一角，从取血部位刮取约4-5微升血量（相当于火柴头大小），使血滴与平置的载玻片接触，再由里向外一个方向旋转，转2~4圈，再回到圆心收起，涂成直径0.8~1cm大小圆形厚血膜。水平放置，务必使血膜厚薄均匀，过厚易于脱落，过薄达不到检出率的要求。血膜制作（涂片操作）血膜制作（涂片操作）薄血膜取洁净的载玻片2张，1张以左手拇指，食指夹持载玻片两端（手指切勿接触玻片表面），用另1张边缘平滑（最好为磨口边缘）的载玻片做推片，用推片一端边缘的中点从取血部分取约1微升的血量（相当于1/4火柴头大小），使血滴与平置的载玻片接触，并形成25~30度夹角，待血液向两侧扩展约2cm长度时，均匀而迅速地轻轻向左推出（约2.5cm长）。将推玻片向1的方向稍抽回，当血液充满推玻片适当宽度（约2cm）后，以一定均匀的速度向2的方向滑动（约2.5cm）。血涂片质量评价：血膜均匀、厚薄度合适、无空泡、无划痕薄血膜头体尾位置和形状好、无停顿起伏、两侧留出空间注意：血滴大，速度快、角度大血膜厚血滴小，速度慢、角度小血膜薄血膜制作（涂片操作）涂制厚、薄血膜的位置通常是将厚、薄血膜涂在一张载片上。方法是将载片分为6等分，第1、2格备贴标签及编号用；厚血膜涂在第3格中央，薄血膜涂在第4格前缘至第6格中部。作为标本的血片每张玻片涂厚、薄血膜各1个；门诊和发热病人血片每片1人，涂2个厚血膜1个薄血膜，以防血膜脱落而影响检查；疟疾调查时，每张玻片可涂制2~3人血膜。标本片发热病人血片标签标签厚、薄血膜的位置每张载玻片上可做1个薄血膜和1个厚血膜，如图2.5cm各种不同的疟疾血片涂制法：标准血片门诊发热病人血片居民普查血片血膜制作（涂片操作）血膜编号血膜制成后，立即用特种蜡笔或水笔于玻片面上写上受检者的号码，以防差错，待薄血膜干后再用铅笔于薄血膜中写上血片种类的代号和受检者的个人编号，依次顺序插入标本盒内。血膜制作的注意事项1.玻片清洗时，避免玻片碰撞、磨损。制作血膜的载玻片必须完全清洁而毫无油渍或污垢。制片时，手指只能持载片的边缘，不能接触玻片表面，以免油污使薄血膜产生空白区以及厚血膜脱落。作为推片的玻片边缘一定要平滑，才能使推出的血膜均匀一致。血膜制作的注意事项2.刚涂制的血膜要平放在标本盒内，厚血膜未干前勿使标本盒倾斜，以免血膜倾向一侧，造成血膜厚薄不均，厚处不易溶血和着色而影响检查结果；晾干血膜时应注意防尘、防止苍蝇、蟑螂等昆虫吮吸血膜，凉干后应及时装入标本盒并盖严，新的木制标本盒需敞开放置一段时间，让醇、醛等物质挥发后才能使用，以免厚血膜红蛋白被其固定，不能溶血导致染色效果不佳。血膜制作的注意事项3.血膜让其自然干燥，切忌用太阳晒或火烤，干透后才能用甲醇固定薄血膜，并对厚血膜溶血。夏天标本尽可能24~48小时内固定、溶血和染色；冬天也不能超过72小时。放置时间越久，厚血膜越不易溶血，染色效果也差。若不能及时染色，薄血膜宜先用甲醇固定，然后用蒸馏水（或过滤的清水）对厚血膜溶血，晾干固定后装入盒内盖严，待以后染色。血膜染色一、染液的种类及染色原理染液种类：对镜检疟原虫染色虽然种类名称很多，但都是从罗门诺夫斯基氏创造的多色性染液变化过来的。多色性染液可分为水溶液和醇溶液两类。水溶液类有罗氏（Romanowsky）染液、费氏(Field)染液等；醇溶液有吉氏（Giemsa）染液、瑞氏（Wright）染液等。血膜染色（一）染液的种类醇溶液类:有吉氏（Giemsa）染液、瑞氏（Wright）染液等。是在水溶液染液的基础上改进发展而成。目前我们推荐的是运用醇溶液类中的吉氏（Giemsa）染液血膜染色（二）染色的原理染色原理是染料于被染物的阴阳离子互相吸附而结合的一种化学反应。各种细胞和疟原虫主要是由不同的蛋白质或类氨基酸组成。不同的氨基酸均含有氨基（NH2）和羧基（COOH）。在游离状态时，氨基（NH2）获得一个氢离子成为带阳电的离子（NH3+）；而羧基失掉一个氢离子成为带阴电的离子（COO—）。血膜染色（二）染色的原理主要染料都含有美蓝、伊红和美蓝氧化后的天青。美蓝的有色基团带阳离子，是一种碱性染料，用的是盐酸美蓝。溶于水后离解为带阴电的氯离子和能着色的美蓝阳离子。伊红的有色基团带阴离子，是一种酸性染料，染色用的是伊红钠盐。溶于水中时离解为带阳电的钠离子和带阴电的伊红离子。天青为美蓝氧化而成。虽为碱性染剂，在染色中起染媒作用。血膜染色（二）染色的原理伊红主要离解为酸性的阳离子，在遇到碱性的蛋白质如血红蛋白、嗜伊红白血球颗粒等即可结合成不易溶于水的沈淀物染成红色。美兰主要离解为碱性的美兰离子，在遇到酸性蛋白质如疟原虫、淋巴和大单核细胞的胞浆、嗜碱性白细胞的颗粒等即可结合染成兰色。血膜染色（二）染色的原理美兰与伊红都不能使原虫和白细胞的核着色，必须由天青作为媒介（染媒）才能使其着色。天青虽然也是碱性染剂，但又具有染媒作用，使原虫核和白细胞核等原来只能染上极淡蓝色的结构染上显著的酸性染剂伊红，这样，就使白细胞粗大的核染成显著的既蓝又红的紫蓝色，而较小或菲薄的原虫核和淋巴细胞原浆中的颗粒染成紫红色。血膜染色（二）染色的原理染色化学反应反应的示意图：疟原虫细胞浆的阴离子（COO—）＋美蓝阳离子—→呈蓝色┏天青（染媒作用）疟原虫核的阳离子（NH3+）＋┫－→呈紫红色┗伊红阴离子血膜染色（二）染色的原理蛋白质本身是阴阳电荷是相等，带有两基性的。所以其所带阴阳电荷的数量可受周围液体的酸碱度（PH）而改变，在偏酸的溶液中阳离子增加，易于伊红结合，着色偏红。在偏碱的溶液中阴离子增加，易于美蓝结合，着色偏蓝。这就说明了为何配制染液的酸碱度直接影响了血片染色的质量，偏酸着色过红，偏碱着色过蓝。所以在染血片时稀释液要控制在PH7.2，最为适宜，疟原虫的结构才能清晰可见。吉氏染色血片外观偏酸偏碱标准1、吉氏染液的配制：这是目前最常用的疟原虫染色剂，它具有方便、染色效果稳定的优点，也是我们推荐的染色方法。将吉氏粉5g置于研钵中，加入少量甘油充分研磨，然后边加边磨，至甘油250ml加完为止，倒入500ml有塞玻璃瓶中。在研钵中加入少量甲醇，洗掉剩余部分，倒入瓶内，再次加甲醇，洗后再倒入瓶中，至甲醇250ml洗清研钵中甘油为止。塞紧瓶塞，充分摇匀，置室温内，每天用力摇动溶液5分钟，3天后即可使用。也可在带有紧口瓶塞的硬质玻璃瓶中放入约50个玻璃珠（直径3~5mm），用玻璃漏斗把甘油灌入瓶中，再把吉氏粉放入漏斗中，用甲醇缓慢地把所有染料粉冲入瓶内，塞紧瓶塞，置于室温内，每天用力摇动5分钟，3天后即可使用。血膜染色（三）染液的配制和染色方法吉氏染液染色方法：先用甲醇固定薄血膜，待干后进行染色。亦可在固定薄血膜后用清水对厚血膜溶脱血红蛋白，然后才进行染色。成批血片染色：将已固定薄血膜的血片插入染色缸，倒入2%吉氏染液稀释液（2毫升原液加中性蒸馏水98毫升稀释均匀即成），同时对厚薄血膜染色30分钟，然后用清水注入染缸将染液通过溢出方式洗去，再用清水浸洗1-2次，干净后将血片标本（血膜面朝下）插于晾干板上，待干后镜检。单张血片染色：薄血膜经固定干燥后，用中性蒸馏水（或娃哈哈矿泉水）1ml，加吉氏母液1~2滴，混合均匀后滴入血片标本上，染色10~20分钟，然后用清水轻轻将片上的染液冲洗干净，晾干镜检。2、瑞式染液的配制：将瑞氏染剂粉1g置于研钵内，加入15ml甘油充分研磨后，倒入有塞玻璃瓶中，再用500ml甲醇洗出研钵中的甘油溶液，倒入瓶中，摇匀后，置室温下，每天摇动5分钟，3天后即可使用。此方法染色的时间短，但染色效果不如吉氏染液效果稳定，又不能大量血片染色，常用于门诊应急情况下血片染色。瑞氏染液的染色方法：先用蜡笔在厚、薄血膜间划一界限，滴几滴蒸馏水在厚血膜上溶血。溶血后倾去水滴。在薄血膜上加瑞氏染液6～7滴，摇动玻片均匀染色30秒。然后再加10～12滴蒸馏水于薄血膜上，摇动玻片将染液与蒸馏水混合均匀后，用吸管把染液引到厚血膜上，使厚血膜再染色5分钟。用清水轻轻冲去染液，晾干镜检。（四）影响染色效果的因素血片染色好坏除了与玻片是否清洁，血片制作质量好坏等有关外，还受到以下几个因素的影响：1.染料溶剂的质量：染料、甲醇和甘油如果不纯，常使配制的染液偏酸或偏碱而影响染色效果。因此必须用分析纯的甲醇和中性甘油，而且在配制时所用的器具必须干净而无水份。（四）影响染色效果的因素2.染液的新旧：新配制的染液因色素尚未充分溶解，染色力较弱且常有沉渣。染液存放时间越久，染色力越强。通常在染液配制1~2周后才使用，盛装染液的瓶子应加塞盖密。以防吸潮而影响染液质量。（四）影响染色效果的因素3.染液的稀释浓度：染液的浓度高其着色就快而深，染色时间相对缩短，疟原虫寄生红细胞的薛氏点粗大显著，但颜色常偏蓝；染液浓度过低则染色时间相对长一些，颜色偏酸红，薛氏点不明显或消失。（四）影响染色效果的因素4.染液稀释后使用时间：染液的主要成份是美蓝、伊红和由美蓝氧化产生的天青，三者能在醇溶液中溶解，但在水溶液中伊红遇到美蓝和天青即产生沉淀。因此，必须在稀释染液当时使用，一般在30分钟内染色力最强。（四）影响染色效果的因素5.染色时间：染色时间长染色效果好，反之较差。室温高则着色快，染色时间可略缩短，气温低可适当延长。因此染色时间应根据染液的质量、新旧、稀释