GPC凝胶色谱实验步骤

一、实验目的：1.掌握PL—120型号凝胶渗透色谱（gelpermeationchromatography，GPC）的工作原理。2.掌握凝胶渗透色谱仪的基本操作及数据处理方法。3.利用凝胶渗透色谱仪测定聚合物的分子量及其分布。二、基本原理：分子量的多分散性是高聚物的基本特征之一。聚合物的性能与其分子量和分子量分布密切相关。凝胶渗透色谱（gelpermeationchromatography，GPC）是液相色谱的一个分支，已成为测定聚合物分子量分布和结构的最有效手段。其还可测定聚合物的支化度，共聚物及共混物的组成。采用制备型的色谱仪，可将聚合物按分子量的大小分级，制备窄分布试样，供进一步分析和测定其结构。该方法的优点是：快捷、简便、重视性好、进样量少、自动化程度高。凝胶色谱的分离机理众说不一，有体积排除、限制扩散、与流动分离等各种解释。实验证明，体积排除的分离机理起主要作用。因此，这一技术又被赋予另一个名称：体积排除色谱（sizeexclusionchromatography，SEC）、图1.GPC分离过程示意图圆球表示颗粒；黑点表示溶质分子在凝胶色谱中会有三种情况，一是分子很小，能进入分子筛全部的内孔隙；二是分子很大，完全不能进入凝胶的任何内孔隙；三是分子大小适中，能进入凝胶的内孔隙中孔径大小相应的部分。大、中、小三类分子彼此间较易分开，但每种凝胶分离范围之外的分子，在不改变凝胶种类的情况下是很难分离的。对于分子大小不同，但同属于凝胶分离范围内各种分子，在凝胶床中的分布情况是不同的：分子较大的只能进入孔径较大的那一部分凝胶孔隙内，而分子较小的可进入较多的凝胶颗粒内，这样分子较大的在凝胶床内移动距离较短，分子较小的移动距离较长。于是分子较大的先通过凝胶床而分子较小的后通过凝胶床，这样就利用分子筛可将分子量不同的物质分离。另外，凝胶本身具有三维网状结构，大的分子在通过这种网状结构上的孔隙时阻力较大，小分子通过时阻力较小。分子量大小不同的多种成份在通过凝胶床时，按照分子量大小排队，凝胶表现分子筛效应。GPC色谱柱装填的是多孔性凝胶（如最常用的高度交联聚苯乙烯凝胶）或多孔微球（如多孔硅胶和多孔玻璃球），它们的孔径大小有一定的分布，并与待分离的聚合物分子尺寸可相比拟。GPC仪工作流程图如2图所示。图2.GPC仪工作流程图色谱柱总体积为Vt，载体骨架体积为Vg，载体中孔洞总体积为Vi，载体粒间体积为V0，则Vt＝Vg＋V0＋ViV0和Vi之和构成柱内的空间。溶剂分子体积远小于孔的尺寸，在柱内的整个空间（V0＋Vi）活动；高分子的体积若比孔的尺寸大，载体中任何孔均不能进入，只能在载体粒间流过，其淋出体积是V0；高分子的体积若足够小，如同溶剂分子尺寸，所有的载体孔均可以进出，其淋出体积为（V0＋Vi）；高分子的体积是中等大小的尺寸，它只能在载体孔Vi的一部分孔中进出，其淋出体积Ve为Ve＝V0＋KViK为分配系数，其数值0≤K≤l，与聚合物分子尺寸大小和在填料孔内、外的浓度比有关。当聚合物分子完全排除时，K＝0；在完全渗透时，K＝1（见图4-3）。当K＝0时，Ve＝V0；此处所对应的聚合物分子量是该色谱柱的渗透极限（PL），商品GPC仪器的PL常用聚苯乙烯的分子量表示。聚合物分子量超过PL值时，只能在V0以前被淋洗出来，没有分离效果。V0和Vg对分离作用没有贡献，应设法减小；Vi是分离的基础，其值越大柱子分离效果越好。制备孔容大，能承受压力，粒度小，又分布均匀，外形规则（球形）的多孔载体，让其尽可能紧密装填以提高分离能力。柱效的高低，常采用理论塔板数N和分离度R来作定性的描述。测定N的方法可以用小分子物质作出色谱图，从图上求得流出体积Ve和峰宽W，以下式计算N值：N＝（4Ve／W）2，N值越大，意味着柱子的效率越高。“l”、“2”代表分子量不同的两种标准样品，Ve,1、Ve,2、W1，W2为其淋出体积和峰宽，分离度R的计算为,2,1122eeVVRWW，若R≥1，则完全分离。上面阐述的GPC分离机理只有在流速很低，溶剂粘度很小，没有吸附，扩散处于平衡的特殊条件下成立，否则会得出不合理的结果。实验测定聚合物GPC谱图，所得各个级份的分子量测定，有直接法和间接法。直接法是指GPC仪和粘度计或光散射仪联用；而最常用的间接法则用一系列分子量已知的单分散的（分子量比较均一）标准样品，求得其各自的淋出体积Ve，作出logM对Ve校正曲线（图4-3）。logM＝A－BVe-----------------------------------------（1）当logM＞logMa时，曲线与纵轴平行，表明此时的流出体积（V0）和样品的分子量是无关，V0即为柱中填料的粒间体积，Ma就是这种填料的渗透极限。当logM＜logMa时，Ve对M的依赖变得非常迟钝，没有实用价值。在logMa和logMd点之间为一直线，即式（1）表达的校正曲线。式中A、B为常数，与仪器参数、填料和实验温度、流速、溶剂等操作条件有关，B是曲线斜率，是柱子性能的重要参数，B数值越小，柱子的分辨率越高。上述订定的校准曲线只能用于与标准物质化学结构相同的高聚物，若待分析样品的结构不同于标准物质，需用普适校准线。GPC法是按分子尺寸大小分离的，即淋出体积与分子线团体积有关，利用Flory的粘度公式：3'RM'3MRR为分子线团等效球体半径。[η]M是体积量纲，称为流体力学体积。众多的实验中得出[η]M的对数与Ve有线性关系。这种关系对绝大多数的高聚物具有普适性。普适校准曲线为''log[]eMABV---------------------------------（2）因为在相同的淋洗体积时，有[η]1M1＝[η]2M2-------------------------------------（3）式中下标1和2分别代表标样和试样。它们的Mark－Houwink方程分别为1111[]KM2222[]KM因此可得12211111212KMMK------------------------------（4）或112122211logloglog11KMMK-------------------（5）将（1）式代入（5），即得待测试样的标准曲线方程11121222111loglog111eeKMABVABVKK1、K2、α1、α2可以从手册查到，从而由第一种聚合物的M-Ve校正曲线，换算成第二种聚合物的M-Ve曲线，即从聚丙稀标样作出的M-Ve校正曲线，可以换算成各种聚合物的校正曲线。有了校正曲线，即可根据Ve读得相应的分子量。一种聚合物的GPC校正曲线不能用于另一种聚合物，因而用GPC测定某种聚合物的分子量时，需先用该种聚合物的标样测定校正曲线。但是除了聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等少数聚合物的标样以外，大多数的聚合物的标样不易获得，多数时候只能借用聚苯乙烯的校正曲线，因此测得的分子量M值有误差，只具有相对意义。用GPC方法不但可以得到分子量分布，还可以根据GPC谱图求算平均分子量和多分散系数，特别是当今的GPC仪都配有数据处理系统，可与GPC谱图同时给出各种平均分子量和多分散系数，无需人工处理。三、仪器与样品四氢呋喃THF（流动相）聚合物样品（如PS）样品瓶注射器（100μl）样品过滤头注射器（5ml）PL—120型GPC色谱仪四、实验步骤1用超声波在减压的条件下对流动相（THF）经行减压退气。21．溶液配制：分别配制5ml的聚苯乙烯标样及待测样品的溶液。2．PL—120型液相色谱仪的启动：（1）色谱级四氢呋喃注入泵的溶剂瓶，检测器废液出口接废液回收瓶。（2）打开计算机，联机记录。（3）依次打开泵（Waters-1515），打开示差折光检测器（2414），柱温箱。（4）打开Breeze2工作站。（5）启动泵：从抽液阀排管路气泡；向右打开参比阀，在工作站上设定4ml/min流速，排赶泵内气泡。大约3分种后在工作站上停止流速。将参比阀向左关闭；在工作站上设定在5分钟内升至0.8ml/min流速；（6）启动示差折光检测器（Waters-2414）在检测器面板上设定温度.Dec=40℃，Col=45℃.按shiftpurge使LCD屏幕上出现“”符号。平衡系统，直到LCD显示稳定。按shiftpurge键，使“”负号消失。3.运行样品。（1）在Breeze2工作站中调用已经编辑好的仪器方法。（2）点击平衡系统，观察基线至平衡。（3）停止观察基线。（4）在样品表中编辑待测样品的信息。（5）点击运行样品表图标。按照对话框提示输入样品组名称，点击“等待用户”。点击“确定”。（6）将进样器把手扳到“LOAD”位（动作要迅速），用进样注射器吸取样品100μl，注意排除气泡，并匀速注入进样器。（7）观察工作站提示“等待进样”，这时将进样器把手扳到“INJECT”位（动作要迅速），即进样完成。（8）等待完成采集。4．试验结束（1）应清洗进样器。（2）检测器温度设为OFF。待温度下降后关机。（3）柱温设为OFF,保持流速不低于0.2ml/min,直到温度在室温附近，方可以停流速，关柱温箱。（4）关泵。5.数据备份。将所使用的项目备份到指定的计算机路径。五、记录及数据处理1．GPC谱图的归一化处理如果仪器和测试条件不变，那么实验得到的谱图可作为试样之间分子量分布的一种直观比较。一般地，应将原始谱图进行“归一化”后再比较。所谓“归一化”，就是把原始谱图的纵坐标转换为重量分数，以便于比较不同的实验结果和简化计算。具体作法：确定色谱图的基线后，把色谱峰下的淋出体积等分为20个计算点。记下这些计算点处的总坐标高度Hi（它正比于被测试样的重量浓度）。把所有的Hi加和后得到ΣHi（它正比于被测试样的总浓度）。那么，Hi/ΣHi就等于各计算点处的组分点总试样的重量分数，以Hi/ΣH对Ve（或logM）作图就得归一化的GPC图。2．计算wM、nM、M及分散度d1）平均分子量定义法将谱峰下的Ve分成若干等分，则各点的重量分数Wi=Hi/∑Hi。按定义有：wiiMMW；1iniWMM；12iiMWM；wnMdM计算所需的Mi值可由校正曲线上查得。六、注意事项：1、样品应尽量采用四氢呋喃溶剂配制。2、开机后一定要基线稳定后才可测量，否则样品测试误差加大。3、未经允许不可接触任何设备，包括软管。七、思考题：1．色谱柱是如何将高聚物分级的？影响柱效的因素有哪些？2．本实验中校准曲线的线性关系，在色谱柱重装或更换色谱柱后，能否再使用？3．GPC法的溶剂选择有什么要求？4．同样分子量样品支化的和线性的分子那个先流出色谱柱？