搜索
第三章食品微生物检验的指标一、菌落总数二、大肠菌群MPN三、致病性微生物四、霉菌与酵母菌数第一节细菌相与食品卫生的关系1、细菌相：指存在于某一物质中的细菌种类及其相对数量的构成。食品中的各种细菌就构成了该食品的细菌相，水中的细菌构成了水的细菌相。细菌相是对细菌的种类面言，在菌相中相对数量较大的一种或几种细菌被称为优势菌。2、嗜冷菌：这类细菌在接近0℃时生长得比较好，最适温度为10℃一20℃，最高温度在30℃一35℃。3、嗜温菌：这类细菌都能在25℃气40℃迅速生长，在55℃不生长。4、嗜热菌：这类细菌生长范围为43℃～75℃，最适为50~C一55~C，在32C以下很难生长。嗜温菌和嗜热菌的一些细菌在生长温度范围上有重迭，产生芽胞的细菌尤其如此。一、细菌相对食品卫生质量的影响1、新鲜畜禽肉的细菌相：主要是嗜温菌，包括大肠菌群、肠球菌、金黄色葡萄球菌、魏氏梭菌和沙门氏菌等。新鲜肉类的细菌相以嗜温菌为主，在温度适宜时，嗜温菌会大量繁殖造成肉的变质，同时发生臭味；在冷藏条件下，嗜温菌生长很慢甚至不生长，嗜冷菌开始大量繁殖，逐渐成为优势菌，最后会导致肉表面形成粘液并产生气味；在冷冻条件下，所有的细菌都不再生长繁殖，因而可以较长期保存而不变质。2、液体蛋晶的细菌相：主要是革兰氏阴性菌，包括假单胞菌属、产碱杆菌属、变形菌属和埃希氏菌属等。3、鲜鱼的细菌相以嗜冷菌为主，有假单胞菌属、黄色杆菌属和弧菌属等。如在水产品中发现了沙门氏菌，一般认为是外来污染，应对该产品的生产，加工过程进行分析、检测，从而找到污染源。二、食品的正常菌相和细菌数量食品及原料都有正常的细菌相，它们因受多种因素的影响，其种类和数量有很大差别。1、鲜肉的细菌相以嗜温菌为主，其次为嗜冷菌。加工良好的鲜肉细菌数为103个／g左右，如加工不良会达到106个／g，肉制品的细菌数约为103—104个／g，大肠菌群MPN为10—102个／100g，金黄色葡萄球菌为10--102个／g。2、鲜蛋的细菌相以革兰氏阳性球菌为主，革兰氏阴性杆菌数量很少。3、液体蛋晶的细菌相是革兰氏阴性菌，包括假单胞菌属、产碱杆菌属、变形菌属和埃希氏菌属，细菌数量一般为104～106个／g，大肠菌群为103～105个／100g，沙门氏菌为1—100个／g。由于食品菌相及其优势种不同，食品的腐败变质也具有相应的特征。有些细菌能分解蛋白质或脂肪或碳水化合物，有些细菌则能使食品产生色素和发光，有的还可以使食品变粘等。第二节菌落总数一、菌落总数的概念及卫生意义1、菌落总数指一定数量或面积的食品样品，在一定条件下进行细菌培养，使每一个活菌只能形成一个肉眼可见的菌落，然后进行菌落计数所得的菌落数量。通常以1g或1ml或1cm2样品中所含的菌落数量来表示。按国家标准方法GB/T4789.2-2008规定，即食品检样经过处理，在一定条件下培养后（如培养基成分、培养温度和时间、pH、需氧性质等），所得1ml或1g检样中形成菌落的总数。标准中规定在需氧情况下，37℃培养48h，能在平板计数琼脂上生长的细菌菌落总数，所以厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌，由于现有条件不能满足其生理需求，故难以繁殖生长。因此菌落总数并不表示实际中的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。2、细菌总数指一定数量或面积的食品样品．经过适当的处理后，在显微镜下对细菌进行直接计数。其中包括各种活菌数和尚未消失的死菌数。细菌总数也称细菌直接显微镜数。通常以1g或1m1或1cm2—样品中的细菌总数来表示。3菌落总数在食品卫生质量评价中的意义1）食品中细菌数量可反映该食品被污染的程度新鲜的食品内部一般是没有或很少有细菌的，但由于外界污染情况不同，食品被细菌污染的多少就有所不同。食品中细菌数量越多，说明被污染的程度就越严重，越不新鲜，对人体健康威胁越大。相反，食品中菌数越少，说明该食品被污染的程度越轻，食品卫生质量越好，对人体健康影响也越小。2）食品中细菌数量可预测食品耐放程度和时间一般讲，细菌数越少，食品耐放时间越长；相反，食品耐放时间就越短，例如用O℃保存牛肉，菌落总数为103cfu／cm2时，可保存18天，而当菌落总数增至lO5cfu／cm2时则只能保存7天。另外，用0℃保存鱼时，菌落总数为105cfu／cm2时可保存6天．而菌落总数在103cfu／cm2时则可保存12天。3）食品中细菌数量可估测出食品腐败状况一般认为日常食品的活菌数为104～107cfu／g。而当活菌数达到108cfu／g则可认为处于初期腐败阶段。例如，活的家禽，皮肤表面的细菌数可低到1.5×103cfu／cm2。而加工后马上检测可达3.5×104cfu／cm2。当菌落数为107cfu/cm2时表示确已经腐败，鸡肉的细菌数达108cfu／cm2时可有气味并变粘。一般讲，食品中细菌数量越多，则会加速腐败变质过程的进程，甚至可能引起食用者的不良反应。二、菌落总数的常规检验方法菌落总数的常规检验方法(GB4789．2-84)：基本操作一般包括：样品的稀释——倾注平皿——培养48（24）小时——计数报告。36±1℃48±2h检样25g(或25mL)样品+225mL稀释液，均质10倍系列稀释选择2～3个适宜样品匀液各取1mL分别加入无菌培养皿每皿中加入15～20mL平板计数琼脂培养基，混匀计算各平板菌落数计算菌落总数报告图3-1菌落总数检验程序（一）样品的处理和稀释：1．操作方法：1）、以无菌操作取检样25g（或25ml)，放于225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振要或研磨制成1：10的均匀稀释液。固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以8000~10000r/min的速度处理1min，制成1：10的均匀稀释液。2）、用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混合均匀，制成1：100的稀释液。3）、另取1ml灭菌吸管，按上项操作顺序，制10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次即换用1支1ml灭菌吸管。2．无菌操作：操作中必须有“无菌操作”的概念，所用玻璃器皿必须是完全灭菌的。所用剪刀、镊子等器具也必须进行消毒处理。样品如果有包装，应用75%乙醇在包装开口处擦拭后取样。操作应当在超净工作台或经过消毒处理的无菌室进行。琼脂平板在工作台暴露15分钟，每个平板不得超过15个菌落。3．采样的代表性：如系固体样品，取样时不应集中一点，宜多采几个部位。固体样品必须经过均质或研磨，液体样品须经过振摇，以获得均匀稀释液。4．稀释液：样品稀释液主要是灭菌生理盐水，有的采用磷酸盐缓冲液（或0.1％蛋白胨水），后者对食品已受损伤的细菌细胞有一定的保护作用。如对含盐量较高的食品（如酱油）进行稀释，可以采用灭菌蒸馏水。（二）倾注培养1．操作方法：1）、根据标准要求或对污染情况的估计，选择2~3个适宜稀释度，分别在制10倍递增稀释的同时，以吸取该稀释度的吸管移取1ml稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做两个平皿。2）将凉至46℃平板计数琼脂培养基注入平皿约15ml，并转动平皿，混合均匀。同时将营养琼脂培养基倾入加有1ml稀释液（不含样品）的灭菌平皿内作空白对照。3）待琼脂凝固后，翻转平板，置36±1℃温箱内培养48±2h，取出计算平板内菌落数目，乘以稀释倍数，即得每克（每毫升）样品所含菌落总数。2．倾注用培养基应在46℃水浴内保温，温度过高会影响细菌生长，过低琼脂易于凝因而不能与菌液充分混匀。如无水浴，应以皮肤感受较热而不烫为宜。倾注培养基的量规定不一，从12~20ml不等，一般以15ml较为适宜，平板过厚可影响观察，太薄又易于干裂。倾注时，培基底部如有沉淀物，应将底部弃去，以免与菌落混淆而影响计数观察。3．为使菌落能在平板上均匀分布，检液加入平皿后，应尽快倾注培养基并旋转混匀，可正反两个方向旋转，检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过20min，以防止细菌有所死亡或繁殖。。4．培养温度一般为37℃（水产品的培养温度，由于其生活环境水温较低，故多采用30℃）。培养时间一般为48h，有些方法只要求24h的培养即可计数。培养箱应保持一定的湿度，琼脂平板培养48h后，培养基失重不应超过15％。5．为了避免食品中的微小颗粒或培基中的杂质与细菌菌落发生混淆，不易分辨，可同时作一稀释液与琼脂培基混合的平板，不经培养，而于4℃环境中放置，以便计数时作对照观察。在某些场合，为了防止食品颗粒与菌落混淆不清，可在营养琼脂中加入氯化三苯四氮唑（TTC），培养后菌落呈红色，易于分别。（三）计数和报告1．操作方法：培养到时间后，计数每个平板上的菌落数。可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落总数后，求出同稀释度的各平板平均菌落数，计算处原始样品中每克（或每ml）中的菌落数，进行报告。2．到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放置于0－4℃，但不得超过24h。3菌落计数可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony-formingunits，CFU）表示。1.选取菌落数在30~300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。2.其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。3.当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。4结果的表述（1）菌落总数的计算方法A.若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每克（或毫升）中菌落总数结果。B.若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按式（l）计算：N=∑C/（n1+0.1n2）d……………………（l）式中：N―样品中菌落数；∑C―平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；nl―第一个适宜稀释度平板上的重复数；n2―第二个适宜稀释度平板上的重复数；d―稀释因子（第一稀释度）。C.若所有稀释度的平板上菌落数均大于300，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。D.若所有稀释度的平板菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。E.若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。F.若所有稀释度的平板菌落数均不在30~300之间，其中一部分小于30或大于300时，则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数计算。5菌落总数的报告(1).菌落数在100以内时，按“四舍五入”原则修约，采用两位有效数字报告。(2).大于或等于100时，第三位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前两位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。(3).若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。(4).若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。(5).称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告。（四）特别注意1不同稀释度的菌落数应与稀释倍数成反比（同一稀释度的二个平板的菌落数应基本接近），即稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数愈多。如出现逆反现象，则应视为检验中的差错（有的食品有时可能出现逆反现象，如酸性饮料等），不应作为检样计数报告的依据。2．当平板上有链状菌落生长时，如呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，则应作为一个菌落计，