Cas9技术

CRISPR/Cas9技术的原理及应用CRISPR-Cas系统的发现1987年，日本大阪大学（OsakaUniversity）在对一种细菌编码的碱性磷酸酶（alkalinephosphatase）基因进行研究时，发现在这个基因编码区域的附近存在一小段不同寻常的DNA片段，这些片段是由简单的重复序列组成，且片段的两端还存在一段不太长的特有序列。CRISPR：成簇的、规律间隔的短回文重复序列（clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats）CRISPR是一个特殊的DNA重复序列家族,广泛分布于细菌和古细菌基因组中。CRISPR位点通常由短的高度保守的重复序列(repeats)组成,重复序列的长度通常21~48bp,重复序列之间被26~72bp间隔序列(spacer)隔开。CRISPR-Cas主要由两部分组成：切割活性域Cas序列识别区域CRISPRCRISPR-Cas结构Cas家族•Cas（CRISPRassociated）：•存在于CRISPR位点附近，是一种双链DNA核酸酶，能在guideRNA引导下对靶位点进行切割。它与Folk酶功能类似，但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用。Cas9CRISPR-Cas系统靶向要求最主要的要求：PAM（protospacer-adjacentmotif）为NGG。人类基因组中，平均8bp即可出现一个PAMCas9技术的应用•基因打靶•激活表达•抑制表达基因打靶通过特异性RNA序列（gRNAforCas9）,引导核酸内切（endonuclease）在靶基因处切割，引起靶基因产生DSB（双链缺口），机体修复DSB的方式有两种:NHEJ，HDR。NHEJ用于Cas9KO项目，HDR用于Cas9-CKO,KI项目基因敲除Knock-out基因敲除Knock-out通过sgRNA引导核酸内切酶Cas9在靶基因处产生DSB（双链缺口），机体以NHEJ修复DSB损伤，修复会产生indel，从而使目的基因移码造成基因功能缺失。基因敲除新技术：Cas9•经典敲除（Knockout）通过同源重组实现基因打靶并实现目的基因的缺失或破坏，使其失去原有功能•新技术（Cas9）通过特异性RNA序列（gRNAforCas9）,引导核酸内切（endonuclease）在靶基因处切割，引起靶基因产生DSB（双链缺口），机体修复DSB的方式有两种:NHEJ，HDR。NHEJ用于Cas9KO项目，HDR用于Cas9-CKO,KI项目Cas9与KI•2013年1月29日在《naturebiotechnology》上发表的《RNA-guidededitingofbacterialgenomesusing•CRISPR-Cassystems》一文中，作者利用CRISPR-Cas系统用设计好的DNA模板替换的相应基因来达到基因的定向修饰。•根据修复方式不同，我们应用TALEN及Cas9核酸内切酶活性时进行基因打靶时主要分为两个方向•基因敲除•基因定向修饰（本质等同于Knock-In）•两者的区别，都是利用同源重组发生基因的定向插入，优势：机体在修复DSB时，如果提供模板，则同源重组效率较只提供模板，机体没有出现DSB修复时的几率高近100倍以上•传统KO，需要较长的同源臂（3000-5000bp），且打靶载体定的构建难度大，耗时长，•既然同源重组效率高，同源臂降低也可发生高效重组,且多位点同时发生同源重组也可实现•以CKO为例，介绍结合Cas9发生KI,完成CKO模型常规CKO借助Cas9切割，利用KI实现常规CKO调节基因转录的Cas9模式WenextexaminedwhetherCRISPRicouldblockatranscriptionfactorfrombindingtoenhancersitesThissuggeststhatdCas9canstericallycompetewithtranscriptionfactorsthathavetightbindingaffinityforDNAelements,furtherimplyingthatCRISPRicanbeusedtoperturbandmaptheregulatoryrolesofdistalandproximalenhancers.设计•打靶载体•鉴定方案ES打靶•药物筛选•中靶鉴定注射•囊胚注射•胚胎移植繁育•繁育•建系鉴定•基因型鉴定•突变检测胚胎冷冻基因打靶小鼠制作流程sgRNA筛选囊胚打靶测试注射•囊胚注射•胚胎移植繁育•繁育•建系鉴定•基因型鉴定•突变检测胚胎冷冻2.5-3mouth37-54day•Cas9技术进行CKO，KI的优缺点优点：1.经典同源重组局限在于需用胚胎干细胞（Embryonicstemcell）进行重组打靶，Cas9技术突破了打靶技术对物种的限制；2.采用Cas9技术进行模型动物制备，所需时间短，最快37天，最慢54天即可确定项目是否能够进行移植，得到F0代鼠时间为3个月；而常规CKO、KI项目得到嵌合鼠时间多为8个月。缺点：1.TALEN、Cas9等进行CKO/KI技术目前仍处于研发测试阶段，目前出现阳性鼠的项目比例为5/25，故目前主推Cas9-CKO/KI可能出现项目不能完成的风险。