4.蛋白质的三维结构P197第5章

4.蛋白质的三维结构P197第5章蛋白质三维结构由氨基酸序列决定，且符合热力学能量最低要求，与溶剂和环境有关。①主链基团之间形成氢键。②暴露在溶剂中（水）的疏水基团最少。③多肽链与环境水（必须水）形成氢键。（一）研究蛋白质构象的方法（1）X-射线衍射法：是目前最明确揭示蛋白质大多数原子空间位置的方法，为研究蛋白质三维结构最主要的方法。步骤为：蛋白质分离、提纯→单晶培养→晶体学初步鉴定→衍生数据收集→结晶解析→结构精修→结构表达。（2）其他方法：NMR、紫外差光谱、荧光和荧光偏振、圆二色性、二维结晶三维重构。（二）稳定蛋白质三维结构的作用力（1）弱相互作用（或称非共价键，或次级键）1.氢键2.疏水作用（熵效应）3.范德华力4.离子键（盐键）（2）共价二硫键（三）酰胺平面和二面角P205图5-11（1）酰胺平面（肽平面）：肽键上的四个原子和相连的Cα1和Cα2所在的平面。（2）两面角：每个氨基酸有三个键参与多肽主链，一个肽键具有双键性质不易旋转，另两个键一个为Cα1与羰基形成的单键，可自由旋转，角度称为ψ，另一个为NH与Cα2形成的单键也可自由旋转，角度称为φ，ψ和φ称为二面角或构象角，原则上可取-1800~+1800之间任意值（实际受立体化学和热力学因素所限制），肽链构象可用两面角ψ和φ来描述，由ψ和φ值可确定多肽主链构象。（四）二级结构P207多肽链折叠的规则方式，是能量平衡和熵效应的结果。主链折叠由氢键维持（主要），疏水基团在分子内，亲水基团在分子表面。常见的二级结构元件：α-螺旋，β-折叠片，β-转角和无规卷曲。（1）α-helix：蛋白质含量最丰富的二级结构。肽链主链围绕中心轴盘绕成螺旋状紧密卷曲的棒状结构，称为α-螺旋。1.两面角ψ和φ分别在-570和-470附近（φ：从Cα向N看，顺时针旋转为正，逆时针为负；ψ：从Cα向羰基看，顺时针为正，逆时针为负。）2.每圈螺旋含约3.6个氨基酸残基，由H键封闭的环中原子数为13，此种α-螺旋又称3.613-螺旋，每周螺距为0.54nm，R基均在螺旋外侧，P208图5-14。3.α-螺旋本身是一个偶极矩，N-末端带部分正电荷，C-末端积累部分负电荷；α-螺旋几乎都是右手螺旋而有手性，并有旋光性，可用圆二色性（CD）光谱研究。4.影响α-螺旋形成的因素：R基小且不带电荷，易形成α-螺旋。如PolyLys在PH7时，R基带正电荷，静电排斥，不易形成α-螺旋，但若PH=12，消除R基正电荷可形成α-螺旋。PolyIle由于R基大，虽不带电也不易形成。Pro由于无酰胺H，不能形成链内氢键，所以当Pro和羟脯氨酸存在时，α-螺旋中断，产生一个结节。（2）β-折叠片：第二种常见的二级结构两条或多条相当伸展的多肽链侧向通过氢键形成的折叠片状结构，如P210图5-17。肽链主链呈锯齿状，肽链长轴互相平行。氢键：在不同的肽链间或同一肽链的不同肽段间形成，氢键与肽链长轴接近垂直。R基：交替分布在片层平面两侧。有两种类型：平行结构（相邻肽链同向）和反平行结构（相邻肽链反向），见P210图5-18。（3）β-转角和β-凸起β-转角是球状蛋白的一种简单的二级结构元件。为第一个氨基酸残基的羰基与第四个残基的N-H氢键键合，形成一紧密的环在肽链回折或弯曲时形成，使多肽链出现1800急剧回折，见P211图5-19。β-转角处Gly和Pro出现几率很高。β-凸起：是在β-折叠股中额外插入一个残基，凸起股产生小弯曲（P212图5-20），可引起肽链方向稍有改变。（4）无规卷曲：泛指那些不能归入明确的二级结构的多肽区段，实际上不是完全无规，而是像其他二级结构那样具有明确而稳定的结构。常构成酶的活性部位和蛋白质的功能部位。（五）超二级结构若干相邻的二级结构单元彼此相互作用，形成种类不多、有规则的二级结构组合或二级结构串，在多种蛋白质中充当三级结构的构件，如P221图5-29所示，有αα，βαβ等。（六）结构域多肽链在二级结构或超二级结构基础上形成的三级结构（局部折叠区），是相对独立的紧密球状实体，称为结构域或域，是球状蛋白质的独立折叠单位。对于较小的球状蛋白质分子或亚基，结构域就是三级结构；对于较大的球状蛋白之或亚基，其三级结构往往由两个或多个结构域缔合而成，为多结构域。结构域形成再缔合成三级结构动力学更为合理，特定三维排布的结构域形成，有利于结构域之间活性中心的形成，结构域之间的柔性肽链形成的铰链区有利于活性中心与底物结合，以及别构中心结合调节物发生别构效应。（七）球状蛋白质的三级结构球状蛋白质三级结构具有明显的折叠层次：二级结构→超二级结构→结构域→三级结构→四级结构（多聚体）。分子是紧密球体或椭球状实体，所有原子体积占72~77%，空腔约25%。疏水侧链埋藏在分子内部，亲水侧链暴露在分子表面，球状蛋白是水溶性的。球状蛋白表面上的疏水空穴常用于结合底物、效应物等配体，为行使生物功能的活性部位。（八）蛋白质折叠和结构预测（1）蛋白质变性：天然蛋白质分子受某些物理化学因素，如热、紫外线照射或酸、碱、有机溶剂、变性基的影响生物活性丧失，溶解度降低及物理化学常数改变的过程称为蛋白质变性。蛋白质变性为分子中次级键破坏，天然构象解体，但变性不涉及共价键（肽键和二硫键）的破裂，一级结构保持完好，只是物化性质和生化性质改变。变性剂：①能与多肽主链竞争氢键，破坏二级结构，如尿素、盐酸胍等；②表面活性剂：破坏蛋白质疏水相互作用，使非极性基团暴露于介质水中，如十二烷基硫酸钠。变性是一个协调过程，在所加变性剂很窄的浓度范围内，或很窄的pH或温度区间内突然发生。（2）氨基酸序列规定蛋白质的三维结构核糖核酸酶的变性和复性试验：牛胰核糖核酸酶，为124个氨基酸残基组成单链，包含四个二硫键。变性：加8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍和巯基乙醇（还原二硫键），酶变性，紧密结构伸展成松散的无规卷曲构象。复性：将尿素等变性剂和巯基乙醇用透析法除去，酶活性又可恢复，最后达原活性的95~100%。P235图5-49。加入极微量巯基乙醇，有助于二硫键重排，加速酶的复性。复性：变性的蛋白质在一定条件下重建其天然构象恢复其生物活性。蛋白质天然构聚处于能量最低状态，理论上变性是可逆的，但实际上由于复性所需条件复杂，不易满足而常常遇到困难。根据分子生物学一个中心原理：顺序规定构象，活性依靠结构，蛋白质结构是可预测的。全新蛋白质设计和蛋白质工程更需要蛋白质结构预测。（九）亚基缔合和四级结构（1）蛋白质四级结构涉及亚基种类和数目，以及亚基在整个分子中空间排布（对称性），亚基的接触位点（结构互补）和作用力（主要是非共价相互作用）。大多数寡聚蛋白质分子亚基数目为偶数，亚基种类一般是1或2种。（2）四级结构缔合的驱动力：弱相互作用（氢键、疏水相互作用，范氏力，盐键），有的亚基聚合还借助亚基之间的二硫桥，如抗体是由两条重键和两条轻链组成的四聚体，二硫键将两条重链与轻链连接在一起，P276图6-29。（3）亚基缔合方式：亚基缔合主要是疏水相互作用，缔合专一性则由表面的极性基团的氢键和离子键提供。许多蛋白质借异种缔合（相同亚基，但相互作用表面不同）。形成线性或螺旋形的大聚合体，如病毒颗粒外壳，P248图5-56显示人免疫缺陷病毒（HIV-I）的核壳由几百个外壳蛋白亚基组成。（4）四级结构对称性：是四级结构蛋白主要性质之一，有旋转对称轴，如二聚体，四聚体。（5）四级缔合在结构和功能上具有优越性：可增强结构稳定性，提高遗传经济性和效率，使编码所需DNA减少，可使催化基团汇集在一起；具有协同性和别构效应。别构效应：多亚基蛋白质一般具有多个结合部位，结合在蛋白质分子的特定部位上的配体对该分子和其他部位所产生的影响（如改变亲和力或催化能力）称为别构效应。具有别构效应的蛋白质为别构蛋白质，酶称为别构酶，具有调节代谢的功能。