细胞衰老与细胞凋亡

细胞衰老与细胞凋亡衰老和死亡是生命的基本现象，生命要不断的更新，种族要不断的繁衍。而这种过程就是在生与死的矛盾中进行的。至少从细胞水平来看，死亡是不可避免的。衰老过程发生在生物界的整体水平、种群水平、个体水平、细胞水平以及分子水平等不同的层次。衰老是细胞的一种重要的生命活动。100多年前1960sHayflick界限第1节细胞衰老（CELLAGING,CELLSENESCENCE）细胞衰老的研究成人早衰症（Werner氏综合症）婴幼儿早衰症（Hayflick-Guilford综合症）决定细胞衰老的因素在细胞内部，而不在外部环境。决定细胞衰老的表达是细胞核而不是细胞质。（长寿基因和衰老基因）细胞在体内条件下的衰老衰老细胞结构的变化细胞核：核膜的内折，染色质固缩化内质网：有序排列被破坏，弥散于核周胞质中糙面内质网解体，减少。线粒体：数目减少，体积增大;有时可看到嵴。。。致密体：积累增多（是由溶酶体或线粒体转化）膜系统的变化：凝胶相或固相，通透性和流动性降低细胞间间隙连接减少组成间隙连接的膜内颗粒聚集体变小衰老症状原因分析皮肤干燥、发皱头发变白老人斑吸收能力下降细胞水分减少，体积减小细胞内的酶活性降低细胞内色素(脂褐素)的累积细胞膜通透性功能改变无力细胞内呼吸速度减慢衰老症状与原因分析就生物个体而言，在其整个的生长发育过程中也不断地发生细胞选择性地死亡，这对保证机体的生存，保持机体对内外环境变化的适应能力，维持其正常的发育均具有重要意义。此种细胞死亡称为编程性细胞死亡（programmedcelldeath，PCD），也称细胞凋亡（apoptosis）。编程性细胞死亡细胞凋亡（apoptosis）•——由基因控制的自主性有序死亡，亦称程序性死亡(programmedcelldeath,PCD)•Apo-ptosis来源于希腊语，fromfall;细胞的死亡犹如秋天树叶的凋落•1965年Kerr,J.F.R.对大鼠肝脏门静脉结扎后肝细胞溶酶体的观察(JPathol.Bacteriol.90:419,1965)•1972年澳大利亚Kerr和Curry提出~19701975198019851990199520002005020004000600080001000012000Thirtyyearsonapoptosispublications*线虫(C.elegant)中的细胞程序性死亡•线虫:成体959个细胞,但在发育过程中有131个细胞会注定发生PCD•PCD发生时间:1h左右•参与线虫PCD的基因，目前已知的有14个凋亡的回顾(programmedcelldeath,PCD)经典凋亡模型PCD已经提出20多年了，但是发现其生物学上的重大意义还是近年的事。PCD和遗传、进化、发育、病理及至肿瘤的发生、发展及其放疗、化疗等均有密切的关系。２００２年诺贝尔生理学或医学奖分别授予了英国科学家悉尼·布雷内、美国科学家罗伯特·霍维茨和英国科学家约翰·苏尔斯顿，以表彰他们发现了在器官发育和“程序性细胞死亡”过程中的基因规则。SydneyBrenner1/3oftheprizeUnitedKingdomTheMolecularSciencesInstituteBerkeley,CA,USAb.1927(inUnionofSouthAfrica)H.RobertHorvit1/3oftheprizeUSAMassachusettsInstituteofTechnology(MIT)Cambridge,MA,USAb.1947JohnE.SulstonUnitedKingdomTheWellcomeTrustSangerInstituteCambridge,UnitedKingdomb.1942THE2002NOBELPRIZEWINNERTHENOBELDIPlOMA2002年诺贝尔医学与生理学颁奖仪式，瑞典斯德哥尔摩音乐厅。SydneyBrennerreceivinghisNobelPrizefromHisMajestytheKingattheStockholmConcertHall.Photo:HansMehlin,Nobele-Museum1.细胞凋亡和一般性衰老死亡区分开来，证明了细胞凋亡的必然性；2.基因分析与细胞的分裂、分化以及器官的发育联系起来;3.细胞凋亡机理为艾滋病、肿瘤和癌症等疾病的治疗提供了寻找新方法的可能。“程序性细胞死亡”是细胞的一种生理性、主动性的“自觉自杀行为”，这些细胞死得有规律，似乎是按编好了的“程序”进行的，其死亡过程犹如秋天片片树叶的凋落，所以这种细胞死亡又称为“细胞凋亡”。包括人类在内的生物是由细胞组成的，细胞的诞生固然非常重要，但细胞的死亡也重要。。早在２０世纪６０年代初期，科学家就开始探索“程序性细胞死亡”的奥秘。但要揭开这一奥秘，需要选择一个合适的研究对象，像细菌这样的单细胞生物太简单，而像哺乳动物这样由大量细胞组成的生物又太复杂，科学家最终选择了线虫。线虫长仅１毫米，细胞数量不多，功能也不复杂，而且它身体透明，便于用显微镜观测。这３位获奖者的成果为其他科学家研究“程序性细胞死亡”提供了重要基础，后来科学家又在这一领域取得了一系列新成绩。科学家们发现，控制“程序性细胞死亡”的基因有两类，一类是抑制细胞死亡的，另一类是启动或促进细胞死亡的。两类基因相互作用控制细胞正常死亡。如果能发现所有的调控基因，分析其功能，研究出能发挥或抑制这些基因功能的药物，那么就可加速癌细胞自杀，达到治疗癌症的目的，而同时提高免疫细胞的生命力，则达到抵御艾滋病的目的。细胞凋亡与坏死的区别1．细胞凋亡细胞凋亡多发生于生理情况下，故可称为生理性死亡，部分病理刺激也可诱导凋亡。其特征为1.细胞骨架的扰乱，粘附力降低，伴随细胞皱缩而产生的胞质和核的浓缩;2.膜发泡;3.核中沿核周缘染色质凝集，继而染色质降解，凝胶电泳检测呈现180～200bp及其倍数的特征梯度（ladder）;4.形成膜包围的断裂片段的凋亡小体（apoptosisbodies）.膜通透性增高，细胞水肿，内质网膨胀，线粒体膨胀破裂，酶被释放，染色质凝集，核固缩，细胞溶解，胞质内容物释放，导致炎症反应。2．细胞坏死细胞坏死（necrosis）是区别于细胞凋亡的另一种细胞死亡方式，由多种致病因子如局部缺血，物理、化学和生物因子的作用而产生的急性损伤所致，故称为病理性死亡。细胞凋亡与坏死的比较坏死凋亡强刺激弱刺激溶酶释出，炎症反应ATP(-)ATPApoptoticbodies（凋亡小体）哺乳类的细胞凋亡过程---Apoptosis检测细胞凋亡的方法组织切片中的凋亡细胞分散，数量少，迅速为巨噬细胞所吞食。Giemsa染色、孚尔根染色或Hoechest33342等荧光染色。在光镜下镜检、可观察到染色质凝集、边缘化，凋亡小体出现，巨噬细胞的吞食等现象。1．形态学组织切片中坏死灶周围有炎症反应，淋巴细胞集中。死亡凋亡在小鼠肌肉中生长的P815肿瘤细胞中因缺血诱导的坏死，示浓缩的染色质块的病态的边缘、膨胀的线粒体和分解的膜。孚尔根染色、DNA荧光染色可显示染色质凝集、断片等现象。台盼蓝染色，凋亡细胞仍是拒染而坏死细胞是着色的，表明凋亡细胞还保持着一定生物活性。坏死细胞胞质不浓缩而是明显肿胀，无凋亡小体。电镜下凋亡细胞的核缩小，染色质边缘化、凝集、电子密度高。晚期则形成核碎片和胞质内的细胞器混合在一起被细胞膜包围的凋亡小体；内质网到后期膨胀成泡状，胞质密度增高，胞膜绒毛减少；凋亡小体最后脱离胞体，被巨噬细胞所吞噬。正常细胞核凋亡细胞核细胞发生凋亡时，染色质会固缩。所以Hoechst染色时，细胞核会呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染。返回前进ApoptosisofANA-1cellinducedbyCurcumin?Humanlymphomacellstreatedwiththechemotherapyagentcamptothecin.Thecellsthatareundergoingapoptosisappearyellowandshowthecharacteristicmembraneblebbing(bubbleformation)seenincellsdyingviaapoptosis.线虫(C.clegans)凋亡细胞是自身cdc3和ced4基因表达依赖性的，凋亡细胞被邻近细胞吞食。2．DNA电泳提取细胞基因组DNA，通过琼脂糖凝胶电泳，凋亡细胞DNA显示出180～200bp及其不同倍数的梯带，被视为最典型的凋亡指标。因被激活的核酸内切酶选择性地在核小体的连接段（linker）处切断所致。坏死细胞DNA则被核酸内切酶无规则地切断，在培养液中细胞溶解后放出DNA片段，故在电泳胶上呈弥散的涂抹状。DNA电泳–+necrosisapoptosis3．流式细胞光度术由于核酸内切酶对DNA的降解成小片段，通过固定改变膜通透性，经PI或Hoechest33342染色，G1期出现低于2CDNA含量的峰，成为细胞凋亡的重要标志之一。全反式维甲酸处理人HL-60细胞后，流式细胞光度仪对细胞DNA含量分析药物处理后第5、6天明显出现Gl期小峰4．凋亡细胞的原位标记由于凋亡细胞DNA为核酸内切酶降解产生3'OH的缺口和末端，故可用原位缺口平移法(insitunicktranslation)或原位末端标记法（TUNEL）显示凋亡细胞。根据需要可采用生物素、地高辛、荧光素和同位素等标记物，如标记的荧光素可以在流式细胞仪上进行定量分析凋亡与非凋亡细胞。原位标记法的最大优点在于，能在组织切片上识别难于判断的凋亡细胞，不足之处为缺乏专一性，但可结合形态学予以正确判断。HL-60cells（急粒，p53缺陷）被喜树碱诱导3小时。DNA段端被荧光标记的脱氧核苷酸末端转移酶标记。5．细胞膜磷脂酰丝氨酸（PS）荧光显示PS在非凋亡细胞中分布于细胞内膜，细胞凋亡后，细胞内膜转至膜外，PS被巨噬细胞识别后被吞噬。而PS出现在细胞膜外，可作为凋亡细胞的标志。钙结合蛋白(annexinV)依靠Ca2+与PS结合，使用荧光标记的钙结合蛋白(annexinV—fluos)及PI两种荧光可在流式细胞仪上定量地区别凋亡、坏死和正常的细胞。亦可用荧光显微镜鉴定个别的凋亡细胞。Jurkat人类白血病T细胞经喜树碱处理，ps外翻，早期凋亡特异性的特征被annexin－5检测到。晚期凋亡和坏死细胞被pi染色confocalmicroscopy共聚焦显微镜用于检测凋亡细胞凋亡的生物学意义细胞凋亡是机体自我保护机制，是长期遗传、进化的结果，以保证生物的世代延续。•①确保正常发育生长：清除多余的细胞•②维持内环境稳定：清除受损、突变、衰老的细胞•③积极防御功能：对病毒感染细胞阻止复制细胞凋亡的过程•1．凋亡信号转导：启动信号Ca2+、cAMP、神经酰胺•2．凋亡基因激活：表达酶类和其他物质•3．细胞凋亡的执行：核酸内切酶(DNase)和Caspases•4．凋亡细胞的清除：被临近的Mφ或其他细胞吞噬分解凋亡时细胞的主要变化•形态学改变→胞膜空泡化→固缩→出芽→染色质边集脱接触→→凋亡小体细胞凋亡的生化改变•1．DNA的片段化：梯状条带形成？•核小体连接区被切开：染色质300kb50kb180~200bp或其整倍数片段5min90min2．内源性核酸内切酶激活及其作用•由一系列胞内信号转导环节激活，执行染色质DNA切割Caspase8的激活，需要FADD(Fasassociatedproteinwithdeathdomain)Caspase9激活，需要通过CARD（caspase-recruitmentdomain)、Apaf-1、细胞色素c、ATP等多个因子的参与。细胞色素C、Apaf-1和pro-caspase9组成了“Apoptosome”（凋亡体）3．凋亡蛋白酶（caspases）的激活及其作用•是一组对底物天冬氨酸部位有特异水解作用，其活性中心富含半胱氨酸的蛋白酶（cysteine-containingaspartat