胚胎干细胞

一、概述基本概念干细胞分化发育干细胞分类干细胞的特点胚胎性干细胞类型干细胞o干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。o包括胚胎干细胞和成体干细胞。o干细胞的发育受多种内在机制和微环境因素的影响。（一）基本概念干细胞功能组织发生全能干细胞多能干细胞专能干细胞胚胎干细胞组织干细胞（二）干细胞分类全能干细胞Totipotentstemcells具有无限分化潜能的细胞。可以分化成人体的各种细胞，这些细胞构成人体的各种组织器官。八细胞阶段多能干细胞Multipotentstemcells具有可分化出一种器官的多种组织潜能的干细胞，即能够形成两种或两种以上类型细胞的干细胞。具有自我增殖和分化两种功能。骨髓造血干细胞就是典型的多能干细胞，移植造血干细胞治疗白血病、再生障碍性贫血等血液疾病。专能干细胞多能干细胞进一步分化成专能干细胞，只能分化成某一类型的细胞。又称单能干细胞。如表皮干细胞只能分化产生角化表皮细胞。胚胎干细胞Embryonicstem(ES)Cells来自早期胚胎、原始生殖细胞或畸胎瘤组织等源于胚胎的干细胞，其基本特性是具有稳定地在体外自我更新、并稳定地维持正常核型和发育全能或多能性、能分化为属于外胚层、中胚层和内胚层范畴的各种类型分化细胞，甚至参与个体发育，又称为万能细胞(Multipotentstemcells)。组织干细胞Tissue-specificstemcell指分布在成年生物体组织中负有构建和补充某种组织细胞功能的干细胞。又称为成体干细胞(Adultstemcells)。（三）干细胞分化发育o干细胞的增殖速度一般比较慢。o一旦机体需要时，干细胞就可以进入分化过程，以适应组织器官生长、发育和修复的需要，当干细胞进入分化期时，其增殖速度开始逐渐加快。o干细胞增殖具有自稳性，指干细胞会自我更新维持自身数目的恒定，这是干细胞区别于肿瘤细胞的本质特征。发育早期―囊胚（受精后5－7天）中未分化的细胞。囊胚含有约140个细胞，中心囊胚腔，腔内一侧为内细胞群可以发育成各种组织器官，具有全能性。当内细胞群在培养皿中培养时，称之为胚胎干细胞。胚胎干细胞继续进行分化，形成专能干细胞在胎儿、儿童和成人组织中的专能干细胞统称为成体干细胞在特定的外加条件下，一种组织的的成体干细胞可以“横向分化”成其它组织的功能细胞。干细胞分化为不同血细胞（四）干细胞的特点干细胞具有自我更新和分化潜能。干细胞体积小，核质比例大，端粒酶活性高，能无限增殖。干细胞可连续分裂几代，也可在较长时间内处于静止状态。干细胞通过两种方式生长。对称分裂非对称分裂两种方式生长形成两个相同的干细胞。调节分化蛋白不均匀地分配，一个子细胞不可逆的走向分化终端成为功能专一的分化细胞；另一个保持亲代的特征，仍作为干细胞保留下来。（五）胚胎干细胞类型胚胎干细胞全能性胚胎性干细胞多能性胚胎性干细胞在胚胎发育最早阶段，各个卵裂球发育潜能几乎是等同的，每个细胞可独立地产生完整的机体；能诱导分化为几乎所有类型的细胞，具有很强的生物学可塑性，已属于多能性，略强于组织干细胞。组织来源胚胎性癌细胞，ECembryonalcarcinomacell全能性胚胎干细胞，ESembryonicstemcell多能性胚胎干细胞，EGembryonicgermcell二、ES细胞和EG细胞培养建系技术饲养层细胞培养法无饲养层细胞培养法胚胎细胞来源ES细胞和EG细胞的培养过程ES细胞和EG细胞系的特性和鉴定o体外培养建系ES细胞和EG细胞的技术以小鼠最为成熟，成功率最高。o培养原则是有赖于获得全能性胚胎细胞或细胞团，并建立体外适合其增殖和抑制分化的培养系统。o早期胚胎细胞离体后极易发生分化，解决阻止其分化、确保维持其全能性或多能性是关键。分化抑制物饲养层细胞（feederlayer）特殊细胞的条件培养液（conditionedmedium）分化抑制因子（differentiationinhibitoryfactor，DIF）体外培养ES和EG细胞两大方法饲养层细胞培养法无饲养层细胞培养法原代或初期培养阶段一般都需要依赖于能分泌必需生长因子的饲养层细胞。以添加LIF生长因子或某些特定细胞的条件培养液至含FCS的正常培养液，来替代饲养细胞。（一）饲养层细胞培养法常用的饲养层细胞MEF细胞STO细胞取自各种品系小鼠的12dpc的胚胎，经剪碎和胰蛋白酶消化，常规分离细胞培养为单层散布的成纤维细胞。经丝裂霉素C处理终止细胞分裂后，用作ES细胞培养的饲养层。来自SIM小鼠（S）胚胎的对硫代鸟嘌呤（tyioguanine,T）和乌本苷（ouabain,O）有抗性的成纤维细胞系，主要分泌干细胞生长因子（SCF）和白血病抑制因子（LIF）。用作ES细胞或EG细胞培养的饲养层的MEF或STO细胞均需用10mg/L丝裂霉素C在37℃处理4h，用前经PBS彻底洗涤。（二）无饲养层细胞培养法小鼠ES细胞培养液直接在ES细胞基础培养液中加入重组LIF；Buffalo大鼠肝细胞条件培养液（BRL－CM）；2－3周幼年大鼠心肌细胞条件培养液（RH－CM）。无饲养层的ES细胞培养系统2－3份细胞条件培养液1－2份新鲜的ES细胞培养液10%－20%胎牛血清在胚胎干细胞原代和建系初期，培养ES/EG细胞的成功率不高，还需补充适当的生长因子。建系成功后，可使用无饲养层培养法。不同种属的ES/EG细胞对生长因子的要求不同，如人ES细胞不能和LIF起反应，难以抑制人ES细胞的分化。（三）胚胎细胞来源不同胚胎发育速度和方式存在较大差异。小鼠多用3－4天的胚泡或2－3天的桑椹胚，猪取8－10天的胚泡，绵羊取8－9天的胚泡，人和牛取7－8天的胚泡。体外授精胚胎或重构胚胎在体外培养至所需发育阶段时，也是ES细胞培养的有效材料来源。小鼠采用超排卵途径收集胚胎雌性成年小鼠注射5U孕马血清促性腺激素（MPS），48h后再注射5U人绒毛膜促性腺激素（HCG）；与雄鼠合笼，自然交配，阳性者为0天（即0.5dpc）；第三天至第四天中午（即3.5dpc－4.5dpc）分别剖取孕鼠子宫，冲出早期胚泡，进一步分离培养建立ES细胞系；剖取发育至8.5dpc－10.5dpc时的胚胎，可建立小鼠EG细胞系。人早期胚胎和生殖腺采集新鲜或冷冻保存的受精卵或卵裂期人胚培养至胚泡期，进一步分离ICM细胞，可建立人ES细胞系；经人流途径获取7－8天胚泡或5－9周胚胎的生殖腺，从中分别分离和培养人ES和EG细胞系。（四）ES细胞和EG细胞的培养过程ES细胞的培养过程基本培养液DMEM液15%－20%FCS0.1mmol/Lβ－巯基乙醇50U/ml青霉素、50ug/ml链霉素将胚泡接种于预先铺有作为滋养层而无有丝分裂活性的单层MEF细胞的培养皿中用免疫手术法分离胚泡的ICM细胞，或用常规培养法分离出ICM细胞进一步培养。培养2－3天免疫手术法4－4.5dpc的小鼠胚泡主要由已分化的滋养外层胚层和未分化的ICM细胞组成，前者细胞表面一般已表达主要组织相容性复合体（MHC），能识别其相应抗体和形成免疫复合物，在补体存在时可导致细胞发生免疫溶解。具体操作如下：体外培养的胚泡，用酸性Tyrode`s液（pH2.5）处理，去除透明带；Hank`s洗涤，加入兔抗JCR小鼠脾脏细胞抗血清（抗H－2b）；移至含新鲜豚鼠血清的培养液，Hank`s液洗涤后，移至96孔铺有MEF或STO饲养层细胞和DMEM基本培养液的板内进一步培养。30min胚泡的滋养外胚层细胞呈泡状，发生免疫溶解；而ICM细胞不具H－2b抗原，细胞完整；30min常规培养法未去透明带的胚泡培养3－4天，ICM细胞团从贴壁胚泡内长出来；胰蛋白酶和EDTA混合消化液在37℃消化5min；解离的细胞团移至滋养层的24孔培养板，继续培养4天，可在一些孔内见到巢状胚胎干细胞团；胰蛋白酶消化巢状胚胎干细胞团并继续培养，克隆和纯化ES细胞。视ES细胞巢密度转移到较大容积的培养皿或培养瓶。EG细胞的培养过程哺乳动物原始生殖细胞（PGC）最早发生于近尿囊基部的卵黄内胚层内，随着胚胎发育和纵向转折，卵黄囊的一部分成为胚胎的后肠，PGC取材主要根据其在不同物种的早期胚胎中所处迁移位置而定。1、原始生殖细胞的分离和原代培养收集8.5－10.5dpc小鼠胚胎，用D－Hank`s液轻洗后，在解剖镜下用镊子剖取包含原始生殖细胞（PGC）的生殖嵴组织；以0.02%EDTA液孵育含PGC细胞的生殖嵴组织，37℃,15min；吸管轻吹打散，接种于铺有滋养层的4孔培养板内。基本培养液DMEM液15%－20%FCS0.1mmol/Lβ－巯基乙醇50U/ml青霉素、50ug/ml链霉素2mmol/L谷氨酰胺、1mmol/L丙酮酸钠2、滋养层细胞宜用8代以内的小鼠MEF细胞或STO细胞系。用前经10ug/ml丝裂霉素C在37℃处理2－3h；接种于包被0.1%明胶的培养板或细胞瓶内，培养液为含10%小牛血清的DMEM。3、EG细胞纯化和建系培养物在滋养层细胞上分裂增殖，4－6天后在显微镜下将包含原始生殖细胞的细胞团用胰蛋白酶消化并转移至新滋养层细胞上增殖；重复用胰蛋白酶消化并转移至新的滋养层细胞，经过2－3次过程，一般可产生巢状（nests）生长的干细胞集落；最后将它转移到铺有滋养层细胞的培养瓶内进一步扩增，此时培养液中可减少或省略LIF、SCF和bFGF等生长因子。（五）ES细胞和EG细胞系的特性和鉴定1形态学特征将克隆挑出，用胰蛋白酶消化并接种于新的滋养层或特定的条件培养液中，培养3－4天后，分散的细胞又重新呈岛状或巢状的细胞克隆。圆形或卵圆形，彼此均呈单层或多层紧密堆积而形成岛状或巢状群体生长形态；呈现一个或几个核仁、核质比例高；不同种的ES细胞形态学特征有所不同。人体ES细胞呈扁平状群落，而且细胞界限清楚；小鼠ES细胞或EG细胞虽然聚集成团，但呈悬浮状态，细胞界限也较清楚；猪ES细胞具有特征性细胞骨架蛋白表达的上皮细胞表型。2、发育全能性和分化潜能鉴定免疫组织化学①时期专一性胚胎抗原（SSEA）②碱性磷酸酶（AKP）③Oct－4基因表达④端粒酶（telomerase）⑤体外分化潜能⑥体内分化①时期专一性胚胎抗原（stage-specificembryonicantigen,SSEA）间接免疫荧光法检测ES和EG细胞表面抗原。不同种属具有亚型，小鼠SSEA－1型，人SSEA－3或SSEA－4亚型。②碱性磷酸酶（AKP）小鼠胚胎干细胞中活性较高，已分化细胞中活性明显降低。细胞经1%多聚甲醛固定，直接用AKP底物NBT液染色，未分化细胞具有较高的AKP酶活性，显示深蓝紫色。③Oct－4基因表达Oct－4是生殖系专一性转录因子，在小鼠胚胎发育早期、生殖细胞谱系以及体外培养的多能干细胞是特异性表达的标志基因；人类ES、EG细胞中Oct－4的表达情况尚不明确。④端粒酶（telomerase）端粒酶是一类核糖核蛋白，与控制细胞寿命有关。人ES细胞的端粒酶活性特别高，分化细胞一般难以检测到其活性。⑤体外分化潜能将ES细胞和EG细胞接种于缺乏滋养层细胞和LIF生长因子培养液的琼脂板上，或添加适当的分化诱导物质（如维甲酸），或悬滴培养，细胞黏附成团；培养3－4天后形成拟胚体，最外层分化为较大细胞组成的内胚层样结构，中间为未分化的干细胞；培养8－10天，拟胚体增大，内部出现囊腔，形成囊状胚体，这样的结构可持续3周左右。⑥体内分化不同品系小鼠的ES细胞和EG细胞在体内生长速度和分化能力会有所区别。接种于同一品系的小鼠或免疫缺损小鼠腹股沟、眼窝和腹腔，可形成由内胚层、中胚层和外胚层构成的畸胎瘤，通达组织学检查，可以分析ES细胞或EG细胞的全能性或多能性或限能性的发育潜能。三、ES细胞和EG细胞体外诱导分化基本原理ES细胞和EG细胞定向诱导分化ES细胞体外诱导分化的基本方法ES细胞体外诱导分化的几种细胞（一）基本原理诱导分化是胚胎正常发育过程中最重要