农杆菌介导转化法的概述

农杆菌介导转化法的概述自从1983年转基因植物诞生以来，植物基因工程成为发展最快、应用潜力最大的生物技术领域之一。植物转基因技术是指把从动物、植物或微生物中分离到的目的基因，通过各种方法转移到植物的基因组中，使之稳定遗传并赋予植物新的农艺性状，如抗虫、抗病、抗逆、高产、优质等。[1]目前，应用于植物转基因较多的方法有基因枪轰击法和农杆菌介导法。由于基因枪轰击的随机性，容易出现突变、丢失和引起基因沉默等不利于外源基因在宿主植物的稳定表达的缺点，而农杆菌介导法是一种天然的植物遗传转化系统,外源基因在转基因植物中的拷贝数低、遗传稳定，是最常用的转基因技术[2]。农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌介导转化法在一些单子叶植物（尤其是水稻）中也得到了广泛应用。本文对农杆菌介导转化法进行综述。1关于农杆菌农杆菌[3-5]是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性的感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。与植物基因转化有关的有根瘤农杆菌和发根农杆菌这两种类型。1.1根癌农杆菌根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)含有Ti质粒，能诱导被侵染的植物细胞形成肿瘤，即诱发冠瘿瘤；Ti质粒是农杆菌染色体外的遗传物质，为双链共价闭合环状DNA分子，大小约200-250kb。依据Ti质粒诱导的植物细胞产生的冠瘿碱的种类不同，根癌农杆菌可分为4种类型：章鱼碱型（Octopine）、胭脂碱型（Nopaline）、农杆碱型（Agropine）和琥珀碱型（Succinamopine）。原始的Ti质粒根据其功能的不同可分为4个区：1.1.1T-DNA区(Transfer—DNAregion)：不同来源的菌株，T-DNA的长度在12~24kb，它是在农杆菌侵染细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物基因组中的一段DNA，其携带的基因与肿瘤的形成有关，但与T-DNA本身的转移与整合无关．T-DNA上最重要的是T-DNA区两端的边界各为25bp的重复序列．其中14bp是完全保守的，分10bp(CAGGAATATAT)和4bp(GTAA)不连续的2组．左右2个边界(LB和RB)是T—DNA转移所必需的，只要其存在，T-DNA可以将携带的任何基因转移并整合到植物基因组中，转移的方向是从右向左，T-DNA的右边界在T-DNA的整合中对于靶DNA位点的识别具有重要作用，因此，尤以右边界更为重要。1.1.2毒性区(vir区)：位于T-DNA以外的1个30-40kb的区域内，该区段编码的基因虽然并不整合进植物基因组中，但对T-DNA的转移和整合非常重要。这些基因也称为Ti质粒编码毒性基因(vir)。目前，对章鱼碱型农杆菌Ti质粒pTi15955和胭脂碱型农杆菌Ti质粒pTiC58的vir区进行了全序列分析，在章鱼碱型Ti质粒的vir区发现了8个操纵子，分别为virA-vjrH，共包括23个基因(virA，virB1-virB11，virC1，virC2，virD1-virD4，virE1，virE2，virF，virG，virH)．而胭脂碱型Ti质粒的vir区不含vjrF和virH操纵子，它含有另一个基因tzs，也有学者认为有大约35个vir基因成簇排布于vir区。1.1.3接合转移区(Con区)：该区段存在有与细菌间接合转移有关的基因(tra)，调控Ti质粒在农杆菌间转移。1.1.4复制起始区(ori区)：该区段调控Ti质粒的自我复制。在遗传转化过程中除了Ti质粒上的基因参与外，还有农杆菌染色体基因．染色体基因包chvA、chvB、att、pscA、chvD以及chvB．它们大多编码一些膜相关蛋白，负责细菌向植物受伤细胞趋化移动和帮助细菌附着于植物受伤细胞上。1.2发根农杆菌发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)含有Ri质粒，能够诱导被侵染的植物细胞产生毛发状根。其侵染植物是将其Ri质粒上的T-DNA插入到宿主植物基因组中，这一点与Ti质粒相类似。转移机制也类似，所不同的是vir区和T-DNA区所含基因及其同源性不同。发根农杆菌由于宿主植物损伤部位产生的酚类化合物而附着在植物的细胞壁上，virA的产物是一种跨膜蛋白，进一步激活virG的产物。T-DNA区的TL区具有较高的稳定性，TR区具有与生长素合成有关的基因tmsl和tms2及农杆碱或甘露碱合成基因。TR区可进行改造，这样Ri通过农杆菌细胞膜特定“孔道”进入宿主植物细胞核，进而使T-DNA整合到植物基因组中。2转化过程农杆菌介导的T-DNA的转移和整合是细菌和植物细胞相互作用发生生物学效应的过程，兼具原核生物中的细菌结合转移及真核细胞加工修饰的特点。其转化过程[6-8]如下：2.1细菌在植物伤口处附着，使受伤的植物组织产生酚类化合物，诱导Ti质粒内vir基因的表达．在植物受到创伤后，创伤组织的细胞释放出酚类化合物信号，如乙酰丁香酮（As）。当农杆菌接受到此类信号时，其vir区基因可被诱导转录。另一类诱导化合物是组成植物细胞壁的一些特异单糖，As和单糖可协同诱导Ti质粒上vir区基因的表达。Vir区基因的活化首先是从virA基因开始的。VirA蛋白是一种结合在膜上的化学受体蛋白，可直接对植物产生的酚类化合物感应，其感应部位可能位于胞质区域。VirA蛋白的胞质区域有自激酶的功能，自身被磷酸化激活后，使VirG蛋白活化。VirG蛋白是DNA结合活化蛋白，可以以二体或多体形式结合到vir启动子的特定区域，从而成为其它vir基因转录的激活因子，打开VirB、virC、virD、virE、virH等几个基因。virC、virD、virE参与T-DNA复合体的形成和转移．ChvE可结合一些单糖，也可直接与VirA周质区相互作用，以加强As对Vir基因的诱导。2.2vir基因表达的产物作用于T-DNA产生T-DNA链，进而转化形成T-DNA复合体，随后在植物及细菌蛋白的共同作用下被摄入细胞核内。VirD基因编码的两个产物VirD1和VirD2直接参与加工过程．VirD1蛋白是一种拓扑异构酶，可将超螺旋型DNA变成松弛型DNA．VirD2蛋白具有特异剪切单链DNA的内切酶活性，它可以识别T-DNA底链边界重复序列上的特定位点，并在底链24bp重复序列和第四个碱基之间切割，将T-DNA从Ti质粒上剪切下来，称T-链。切开T-DNA后，VirD2蛋白与T一链的5’端共价结合，避免核酸外切酶降解T一链．新的T-DNA底链以此链为模板，从右端产生的DNA缺口处以5’-3’方向进行合成。被取代的旧链游离出来，与许多VirE2蛋白分子结合组成T-DNA复合体。此外，VirD2作为一个导向蛋白，可以指导整个T-DNA复合体从农杆菌进入到植物细胞核。2.3T-DNA整合进入植物基因组并表达产生生物学效应．T-DNA整合进宿主细胞基因组，是转化过程中最重要也最关键的步骤。T-DNA在寄主细胞染色体上的整合是随机的，但对转录活化区域有所偏好。T-DNA通过与事先断裂的寄主DNA双链(DSB)发生重组来完成整合，进而进行表达。3转化方法目前农杆菌介导转化单子叶植物最常用的方法是共培养法。利用农杆菌与植物离体组织共培养进行转化，一般需要经过严格的组织培养过程以再生植株，因而转化周期比较长。共培养前农杆菌感染愈伤组织的方式有：①将整块愈伤组织浸泡于菌液中静置培养。②将整块愈伤组织浸泡于菌液中摇动培养。③将菌液加至愈伤组织上。通常使用的是第一种方式。现将农杆菌介导的植物遗传转化常采用的方法[9]，简要介绍如下：3.1叶盘法选取健康的无菌苗，用打孔器打出叶圆盘，将带有新鲜伤口的叶圆盘与载有目的基因的农杆菌液进行短期共培养，农杆菌通过伤口使携带外源目的基因的Ti或Ri质粒进入植物细胞，使外源目的基因整合到植物基因组中。它是双子叶植物较为常用也较为简单有效的方法。3.2真空渗入法该法转化的健壮植株倒置浸于装有携带外源目的基因的农杆菌渗入培养基的容器中，经真空处理，造伤，使农杆菌通过伤口感染植株，在农杆菌的介导下，发生遗传转化。它是一种简便、快速、可靠而且不需要经过组织培养阶段即可获得大量转化植株的基因转移方法，具有良好的研究与应用前景。3.3原生质体法在原生质培养的早期，将携带外源目的基因的农杆菌与原生质体共同培养，农杆菌的Ti或Ri就会随着外源信号分子的诱导而导入原生质体的核内，T-DNA就可能整合在受体基因组上。此外，作为载体法，新的转基因方法有：基于Ac/Ds转座系统建立的转化载体；利用噬菌体P1Cre-lox位点的特异性重组系统；利用酵母线粒体I-Scel核酸内切酶特异性诱导植物DNA双链断开引起的同源重组系统；利用双链细菌人造染色体载体系统等，能够提高转化率或转基因位点质量。4研究现状关于禾谷类单子叶植物农杆菌介导的遗传转化，早期的研究多采用其幼胚来评估不同条件下被农杆菌侵染的可能性。结果显示，T-DNA向禾本科植物中的转化没有明显障碍，但人们对整合过程的了解十分有限，同时存在相当大的争议。在此基础上，人们利用大量实验去测试不同谷类植物的不同外植体对农杆菌侵染的反应能力，以期获得稳定的转化细胞或植株。Grimsley等（1987）首先将玉米条纹病毒(maizestreakvirus)的cDNA通过根癌农杆菌转入玉米，转入植株表现出感染症状；Gould等（1991）用根癌农杆菌感染玉米芽尖，得到少量转基因植株；Shen等（1993）观察到农杆菌介导的gus基因转入玉米芽后β-葡糖苷酸酶的表达；Mooney等（1991）采用根癌农杆菌感染小麦胚得到转化细胞；Rainer等（1990）和Chan等（1992）通过根癌农杆菌感染未成熟胚得到少量水稻转基因植株。以上研究工作得到的转化频率很低，且没有足够的分子和遗传证据，这些研究成果很少为大家接受并承认，却是鼓舞人心的，为单子叶植物尤其是禾谷类作物转基因研究的进一步开展奠定了基础。1993年-1994年取得了重大突破，Chan等（1993）以水稻开花授粉后10-12天的幼胚为受体，经农杆菌感染后获得了转基因植株；Hiei等（1997）以水稻成熟胚愈伤组织和未成熟幼胚为受体，获得了较多有严格分子生物学证据的转基因植株，并对农杆菌介导法转化水稻的影响因素进行了详细研究，建立了比较成熟的农杆菌转化水稻的技术体系，为农杆菌介导法转化单子叶植物开辟了先河。从此，农杆菌介导法的转化范围扩展到了许多重要的单子叶植物，包括香蕉、玉米、大麦、小麦、甘蔗、大蒜、洋葱、高梁和黑麦（Chengetal1997；Ishidaetal1996）[10-13]。5存在问题与展望5.1植物受体因子与农杆菌间的作用机理目前对农杆菌介导转化的机理及分子调控已研究比较深入，但对有关植物因子的作用机理还知之甚少。许多研究表明，农杆菌介导单子叶植物遗传转化已具备了与双子叶植物相似的农杆菌本身的必要条件，但单子叶植物的转化相比较而言困难得多，这可能不仅是农杆菌一方的因素，单子叶植物的植物因子也可能起着关键作用，也不排除农杆菌和这些植物因子的相互作用[14]。5.2转化率大多数单子叶植物的转化受其基因型、外植体来源、组织培养难易程度等因素的影响，比较难，以至在重要禾谷类作物中的应用受到一定的限制，与双子叶植物相比，农杆菌转化单子叶植物还存在较大差距，其中烟草、葡萄等双子叶植物的转化效率高达60%以上，而单子叶植物中转化效率较高的禾本科植物还不到30%(蒋玉宝等2005；孟芮等2006)。据统计，单子叶植物用农杆菌转化获得成功的遗传转化率玉米为5%-30%、水稻为29%、籼稻为22%，接近双子叶植物(任永霞等2005)[15]。目前农杆菌介导遗传转化的方法主要有原生质体法、叶盘法和整株感染法等。对于大多数单子叶植物的转化，常受基因型、外植体来源、组织培养难易程度等因素影响而很难成功，因此在许多重要禾谷类作物中的应用受到限制。5.3Ti载体容量禾谷类作物的一些性状，如抗病、抗虫、抗逆、高产优质等，或是数量性状，或是质量性状相关的基因成簇排布，定位在较大的DNA片段