第二章--仪器分析—高效液相色谱法

2020/3/22第二章仪器分析—高效液相色谱法HPLC2020/3/222020/3/22凝胶柱上加上中药提取物2020/3/22洗脱的效果2020/3/22HPLC基本组成示意图HPLC主要由色谱柱、加压泵和检测器组成2020/3/22色谱柱色谱柱是液相分离的核心部件2020/3/22输液泵输液泵分单元等度泵和多元梯度泵2020/3/22检测器对没有紫外吸收的物质的检测，以蒸发光散射检测器用得较多•检测器种类很多，现在最常用的是紫外检测器2020/3/22进样器—手动进样器Rheodyne7725i几乎成了所有液相色谱仪的进样器2020/3/22进样器—手动进样器—六通阀2020/3/22进样器自动进样器可由软件完全控制Waters717Agilent2020/3/22色谱工作站色谱工作站就是HPLC的控制系统外企的在数万元左右，国产的几千元。2020/3/22色谱工作站工作站的两大功能1.控制仪器2.处理数据2020/3/22液相色谱仪器常见种类highperformanceliquidchromatograph2020/3/22液相色谱仪（2）2020/3/22液相色谱仪（3）安捷伦Agilent11002020/3/22液相色谱仪（4）2020/3/22液相色谱仪（5）上海伍丰科学仪器有限公司2020/3/22液相色谱仪（6）戴安公司Ultimate30002020/3/22高效液相色谱法的特点特点：高压、高效、高速现代药物分析最有用的工具和方法2020/3/22高效液相色谱法在药典中的使用1985年版1990年版1995年版2000年版2005年版数量8561212791327比例%0.53.25.110.441.32020/3/22高效液相图谱各成分依次流出色谱柱，从进样到出峰的时间称为保留时间2020/3/22定性方法定性:确定成分归属，依据与对照品相比较时，相同的保留时间2020/3/22定量方法•外标法•内标法•归一法2020/3/22定量方法——外标法对照品浓度对照品峰面积样品峰面积样品浓度•内标法•对照溶液：精密称（量）取对照品和内标物质，分别配成溶液，精密量取各溶液，配成校正因子测定用的对照溶液。•供试品溶液：再取各品种项下含有内标物质的供试品溶液，注入仪器，记录色谱图。sSRRAcfAc校正因子（）''%100%XssXAfcAc含量2020/3/22定量方法——内标法对照品供试品内标物2020/3/22定量方法——归一法29（1）吸附色谱法（2）正相色谱法（3）反相色谱法①一般反相色谱法②反相离子对色谱③反相离子抑制色谱主要分离方法流动相的选择在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。常用溶剂的极性顺序：水(最大)甲酰胺乙腈甲醇乙醇丙醇丙酮二氧六环四氢呋喃甲乙酮正丁醇乙酸乙酯乙醚异丙醚二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳环己烷己烷煤油(最小)31流动相的制备供试品和对照品溶液配制（各两份）系统适用性试验操作前的准备322)(54.521WtnR21)(212WWttRRR理论塔板数（n）：分离度（R）：系统适用性实验：重复性对照溶液连续进样5次相对标准偏差应不大于2.0%33拖尾因子（T）：105.02dWThw0.05h为0.05峰高处的峰宽；为峰极大至峰前沿之间的距离。除另有规定外，T应在0.95～1.05之间1d实例：高效液相色谱外标法测定头孢拉定含量•取含头孢拉定为94.1%和头孢氨苄为2.3%的对照品35.35mg溶解定容为50ml，取10μl注入高效液相色谱仪，测得头孢拉定峰面积为13842558，头孢氨苄峰面积为354934；另称取头孢拉定供试品35.88mg，溶解定容为50ml，取10μl注入高效液相色谱仪，测得头孢拉定峰面积为14158286，头孢氨苄峰面积为472368；按供试品的总量分别计算头孢拉定和头孢氨苄的百分含量。%100%35.35*94.1%14158286*5013842588*10094.8%35.8850XRRXAcAc头孢拉定%100%35.35*2.3%472386*50354934*1003.02%35.8850XRRXAcAc头孢氨苄内标液取正三十二烷加正己烷溶解并稀释成1.0mg/ml溶液对照液精密称取VitE对照品0.2011g置棕色具塞锥形瓶中，精密加入内标液10ml，密塞，振摇使溶解，取1~3ul注入GC仪，测定，计算供试液精密称取供试品0.1998g置棕色具塞锥形瓶中，精密加入内标液10ml，密塞，振摇使溶解，取1~3ul注入GC仪，测定，计算维生素E含量测定对照液797469297456内对AA供试液805741296513内样AA•按《中国药典》2015版（二部）的规定测定维生素E，做系统适用性实验时的数据如上表。•取维生素E对照品20.80mg(98.0%)，精密加入浓度为1.044mg/ml的内标物（正三十二烷）溶液10.00ml溶解，取1μl注入气相色谱仪，对照品峰面积为481736，内标物峰面积为238787，求维生素E的理论塔板数、维生素E与内标物的分离度和校正因子各为多少？再精密称取维生素E供试品22.68mg，内标物28.00mg，用气相色谱法测得供试品峰面积为529887，内标物峰面积为644911，计算供试品中维生素E的含量。w物质Rt/minW(1/2h)/minW/min对照品8.880.250.6内标物5.740.61.2实例2020/3/2222/28.885.54()5.54*69900.25Rhtnw211228.885.742()3.490.61.2RRttRww2387871.0440.967848176320.80*98.0%10.0sSRRAcfAc''''%100%*100%5298870.9678**28.00644911*100%98.2%22.68XXssssXxAAfcfmAAEcm维生素