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实验十诱导表达蛋白的SDS-PAGE电泳检测【实验目的】1.学习和掌握SDS-PAGE电泳原理2.掌握SDS-PAGE电泳检测诱导表达蛋白的方法【实验原理】1.带电颗粒在电场中泳动的速度与电场强度和带电颗粒的净电荷量成正比,而与颗粒半径(分子量和结构)和介质粘度成反比2.若样品为混合的蛋白质溶液时,由于不同蛋白质的等电点和分子量是不同的,因此经电泳后,就形成了泳动度不同的区带结构因素——蛋白质的变性消除(1)强阴离子去污剂:十二烷基磺酸钠(SDS)(2)还原剂:二硫苏糖醇(DTT)(3)物理作用:加热电荷因素——SDS结合消除(1)变性的多肽与SDS结合因而带负电荷(2)多肽与SDS结合的量与多肽的分子量成正比(3)SDS多肽复合物的迁移率只与分子量相关分子筛作用分子量大的蛋白质泳动的速度慢,分子量小的蛋白质泳动的速度快SDS-PAGE电泳丙烯酰胺浓度/%线性分离范围/kDa1512107.55.010-4312-6020-8036-9457-212SDS-PAGE的有效分离范围浓缩胶分离胶1.诱导表达产物(自己上次实验制备)2.SDS-PAGE系统(北京六一)3.电泳仪4.中分子量蛋白质Marker【实验材料】【实验步骤】1.凝胶板的制备2.点样及电泳3.蛋白质的染色和脱色密封条梳子平,凹玻板斜楔板电泳槽1.凝胶板的制备1234SDS-PAGESDS-PAGE分离胶(下)浓缩胶(上)配胶成分水3.3ml4.1ml30%(聚)丙烯酰胺溶液4.0ml1.0ml0.5mol/LTris(pH6.8)---750µl1.5mol/LTris(pH8.8)2.5ml---10%SDS100µl60µlTEMED10µl8µl10%过硫酸铵100µl60µl总体积10ml6ml2人配一组溶液,2人配一块胶灌制分离胶①按照上表配制分离胶溶液②取4.5ml分离胶溶液立即灌入两玻璃板的间隙,梳子前沿1cm处③缓慢覆盖400µl水(200µl/边)④37℃放置20-30分钟⑤凝固好后,倾出水.用滤纸条吸去多余的水分灌制浓缩胶①按照上表配制浓缩胶溶液②取浓缩胶约2.5ml立即灌入两玻璃板的间隙③立即插入梳子(注意,梳子有正反).避免产生气泡.室温放置约30分钟.凝固好后,拔出梳子。④待积层胶聚合完全后,小心的拔出梳子(垂直向上)⑤取出制胶板,拿掉硅胶密封圈后,短板向内放回电泳槽(压紧)⑥将电泳槽与电泳仪连接好(注意正负极),加入Tris-甘氨酸电泳缓冲液,负极一侧要超过短板顶部,正极一侧加至离长板顶部1cm处2.点样及电泳①9个样品10000rpm离心3分钟(注意对称)②按预定顺序加样(每个样品15µL)③每一块胶上一个蛋白质Marker(20µL)④80V进胶,120V电泳.当染料指示到达分离胶底部时,关闭电源停止电泳(约1.5小时)04080120M点样顺序04080120A1或B1A2或B23.蛋白质的染色和脱色①将Tris-甘氨酸电泳缓冲液回收到指定的地方②取出胶板,撬开玻璃板(刀片),将凝胶移入大平皿③向平皿中加入考马斯亮蓝染液,覆盖凝胶即可,染色过夜,按老师指定的位置放置④将染液回收到指定的地方,加入适量脱色液,脱色1-2小时⑤倒掉脱色液,用清水冲洗干净,观察结果,照相【思考题】1.SDS-PAGE电泳的原理？2.SDS-PAGE的应用有哪些？分子生物学实验考试下次实验