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理解·教材新知把握·命题热点应用·落实体验课下综合检测课堂回扣练习命题点一命题点二知识点一知识点二1．1DNA重组技术的基本工具专题11．1DNA重组技术的基本工具1．基因工程突破了生殖隔离，实现了不同种生物间的基因重组。2．不同生物基因能拼接在一起的理论基础是DNA分子都是由4种脱氧核苷酸构成的规则的双螺旋结构。3．外源DNA能在受体细胞表达的理论基础是密码子的通用性。4．DNA重组技术的基本工具有限制性核酸内切酶、DNA连接酶和使基因进入受体细胞的载体。5．限制性核酸内切酶可识别双链DNA分子特定的核苷酸序列，并在特定位点上切割。6．DNA连接酶根据来源不同可分为E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶。E·coliDNA连接酶只能连接黏性末端，而T4DNA连接酶既能连接黏性末端也能连接平末端。7．在基因工程中使用的载体除质粒外，还有λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。基因工程的概念及其诞生与发展1．基因工程的概念基因工程的别名___________________操作环境生物体外操作对象_______操作水平__________________结果创造出人类需要的新的_________和__________DNA重组技术基因DNA分子水平生物类型生物产品2．基因工程的诞生和发展(1)基础理论的重大突破：①_____是遗传物质的证明；②DNA双螺旋结构和_________的确立；③_________的破译。(2)技术发明使基因工程的实施成为可能：①基因转移载体和_______相继发现；②________________技术的发明；③DNA体外重组得到实现，_________________获得成功。DNA中心法则遗传密码工具酶DNA合成和测序重组DNA表达实验(3)基因工程的发展与完善：①1980年，科学家首次培育出世界上第一个转基因小鼠。1983年，世界第一例____________培育成功，基因工程进入迅速发展阶段。②1988年_________的发明，使基因工程进一步发展和完善。转基因烟草PCR技术1．通过分析基因工程的概念，讨论基因工程的原理是什么。提示：基因重组。2．将人的胰岛素基因导入大肠杆菌体内，通过大肠杆菌能大量生产人胰岛素。请分析人胰岛素基因能在大肠杆菌体内表达的理论基础是什么？提示：生物共用一套遗传密码。1．基因重组的三种主要类型(1)交叉互换：减数第一次分裂四分体时期，同源染色体上的非姐妹染色单体间的交叉互换。(2)自由组合：减数第一次分裂后期，非同源染色体上的非等位基因随着非同源染色体的自由组合而组合。(3)基因工程：转基因生物因外源基因导入而获得的新性状是可以遗传的。2．基因工程的理论基础(1)拼接的基础：①基本组成单位相同：不同生物的DNA分子都是由脱氧核苷酸构成的。②空间结构相同：不同生物的DNA分子一般都是由两条反向平行的脱氧核苷酸长链形成的规则的双螺旋结构。③碱基配对方式相同：不同生物的DNA分子中两条链之间的碱基配对方式均是A与T配对，G与C配对。(2)表达的基础：生物界共用一套遗传密码，相同的遗传信息在不同生物体内可表达出相同的蛋白质。DNA重组技术的基本工具1．限制性核酸内切酶(又称限制酶)(1)来源：主要是从_____生物中分离纯化出来的。(2)功能：能够识别双链DNA分子的某种_____核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的___________断开。(3)结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：_____末端和___末端。原核特定磷酸二酯键黏性平2．DNA连接酶(1)作用：将双链______片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的___________。(2)种类：种类比较项目E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶来源______________________特点只能“缝合”具有_________的双链DNA片段既可以“缝合”双链DNA片段互补的________，又可以“缝合”双链DNA片段的_______大肠杆菌T4噬菌体黏性末端黏性末端平末端DNA磷酸二酯键3．运载体(1)作用：将__________送入细胞中。(2)种类：_____、λ噬菌体衍生物和____________等。(3)外源基因质粒动植物病毒1．结合DNA复制的过程分析，限制酶和DNA解旋酶的作用部位有何不同？提示：限制酶作用于磷酸和脱氧核糖之间的磷酸二酯键，DNA解旋酶作用于碱基对之间的氢键。提示：限制性核酸内切酶。识别的碱基序列为：GAATTC，切点在G和A之间。特异性。2．下图所示过程是哪类酶作用的结果？该酶识别的碱基序列及切点是什么？这体现了该类酶具有什么特性？3．观察下图，分析黏性末端和平末端是如何形成的。(1)EcoRI(在G与A之间切割)：(2)SmaI(在G与C之间切割)：提示：限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA两条单链分割开，就形成黏性末端，而从识别序列的中心轴线切开就形成平末端。4．下图中的X酶指的是什么酶？该种酶的使用是否需要选择？为什么？提示：DNA连接酶。需要。E·coliDNA连接酶只能连接黏性末端，而T4DNA连接酶既可以连接黏性末端又可以连接平末端。1．DNA连接酶与限制性核酸内切酶的比较(1)区别：作用应用限制性核酸内切酶使特定部位的磷酸二酯键断裂用于提取目的基因和切割载体DNA连接酶在DNA片段之间重新形成磷酸二酯键用于目的基因和载体的连接(2)两者的关系可表示为：2．限制性核酸内切酶与解旋酶的区别(1)相同点：都是作用于DNA分子中的化学键。(2)不同点：作用部位不同，前者作用于磷酸二酯键，后者作用于氢键。3．DNA连接酶与DNA聚合酶的比较比较项目DNA连接酶DNA聚合酶相同点作用实质相同，都是催化两个核苷酸之间形成磷酸二酯键不同点是否需要模板不需要需要接DNA链双链单链作用过程在两个DNA片段间形成磷酸二酯键将单个核苷酸加到已存在的DNA单链片段上，形成磷酸二酯键作用结果将已存在的DNA片段连接合成新的DNA分子用途基因工程DNA复制4．上述四种酶的作用部位图解(1)作用于a(磷酸二酯键)的酶有：限制酶、DNA连接酶、DNA聚合酶。(2)作用于b(氢键)的酶是解旋酶。[特别提醒](1)不同DNA分子用同一种限制酶切割形成的黏性末端都相同；同一个DNA分子用不同限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同。(2)不同限制酶切割形成的黏性末端，如果互补则可以相互重新配对连接。5．细胞膜上的载体与基因工程中的载体的区别(1)化学本质不同：细胞膜上的载体化学成分是蛋白质；基因工程中的载体可能是物质，如质粒(DNA)、λ噬菌体的衍生物，也可能是生物，如动植物病毒等。(2)功能不同：细胞膜上的载体功能是协助细胞膜控制物质进出细胞；基因工程中的载体是一种“分子运输车”，把目的基因导入受体细胞。以具体实例为素材，考查限制酶的作用及特点[例1]下表所示为常用的限制酶及其识别序列和切割位点，由此推断以下说法，正确的是()限制酶名称识别序列和切割位点限制酶名称识别序列和切割位点BamHⅠKpnⅠEcoRⅠSau3AⅠHindⅡSmaⅠGG↓ATCCCA↓ATTCGTYR↓ACGGTACC↓G↓ATCCCCG↓GG注：Y＝C或T，R＝A或G。A．限制酶切割后不一定形成黏性末端B．限制酶的切割位点一定在识别序列的内部C．不同限制酶切割后一定形成不同的黏性末端D．一种限制酶一定只能识别一种核苷酸序列[思路点拨][精讲精析]由表中信息可知，HindⅡ能识别4种不同的核苷酸序列；Sau3AⅠ酶的切割位点在识别序列的外部；BamHⅠ酶与Sau3AⅠ酶切割后能形成相同的黏性末端；SmaⅠ酶切割后产生的是平末端。[答案]A限制酶的识别序列和切割末端的判断(1)识别序列的特点：遵循碱基互补配对原则，无论是奇数个碱基还是偶数个碱基，都可以找到一条中心轴线，如图，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。如GCCGGCCG以中心线为轴，两侧碱基互补对称；CCAGGGGTCC以AT为轴，两侧碱基互补对称。(2)判断黏性末端或平末端是否由同一种限制酶切割形成的方法是：将黏性末端或平末端之一旋转180°后，看它们是否是完全相同的结构。限制酶是一种核酸切割酶，可识别并切割DNA分子上特定的核苷酸序列。下图为四种限制酶BamHⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ以及BglⅡ的识别序列。箭头表示每一种限制酶的特定切割部位，其中哪两种限制酶所切割出来的DNA片段末端可以互补黏合？其正确的末端互补序列是什么()A．BamHⅠ和EcoRⅠ末端互补序列为AATT—B．BamHⅠ和HindⅢ末端互补序列为GATC—C．EcoRⅠ和HindⅢ末端互补序列为AATT—D．BamHⅠ和BglⅡ末端互补序列为GATC—解析：图中四种限制酶切割DNA分子所形成的黏性末端分别是—C—GCTAG、—C—GTTAA、—T—ATCGA、—T—ACTAG，可知BamHⅠ和BglⅡ切割DNA分子产生的末端的碱基是互补的。答案：D以模式图为依托，考查运载体及其必备条件[例2]目前基因工程所用的质粒载体主要是以天然细菌质粒的各种元件为基础重新组建的人工质粒，pBR322质粒是较早构建的质粒载体，其主要结构如下图所示。(1)构建人工质粒时要有抗性基因，以便于________________________________________________________________。(2)pBR322分子中有单个EcoRⅠ限制酶作用位点，EcoRⅠ只能识别序列—GAATTC—，并只能在G和A之间切割。若在某目的基因的两侧各有1个EcoRⅠ的切点，请画出目的基因两侧被限制酶EcoRⅠ切割后所形成的黏性末端：__________。(3)pBR322分子中另有单个的BamHⅠ限制酶作用位点，现将经BamHⅠ处理后的质粒与用另一种限制酶BglⅡ处理得到的目的基因，通过DNA连接酶作用恢复________键，成功获得了重组质粒，说明___________________________________________________________________________________________。(4)为了检测上述重组质粒是否导入原本无ampR和tetR的大肠杆菌，将大肠杆菌在含氨苄青霉素的培养基上培养，得到如图二的菌落。再将灭菌绒布按到培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布按到含四环素的培养基上培养，得到如图三的结果(空圈表示与图二对照无菌落的位置)。与图三空圈相对应的图二中的菌落表现型是___________________________，图三结果显示，多数大肠杆菌导入的是__________________________________。[思路点拨][精讲精析](1)质粒作为基因表达载体的条件之一是要有抗性基因，以便于筛选(鉴别)目的基因是否导入受体细胞。(2)同一限制酶切割DNA分子产生的黏性末端相同，根据题意可知：该目的基因两侧被限制酶EcoRⅠ切割后所形成的黏性末端为：目的基因—GAATTC—……—GAATTC——CTTAAG—……—CTTAAG—(3)DNA连接酶催化两个DNA片段形成磷酸二酯键；而通过DNA连接酶作用能将两个DNA分子片段连接，表明经两种限制酶(BamHⅠ和BglⅡ)切割得到的DNA片段，其黏性末端相同。(4)由题意知：由于与图三空圈相对应的大肠杆菌能在含氨苄青霉素的培养基上生长，而不能在含四环素的培养基上生长，故可推知与图三空圈相对应的图二中的菌落能抗氨苄青霉素，但不能抗四环素。由图二、图三结果显示，多数大肠杆菌都能抗氨苄青霉素，而经限制酶BamHⅠ作用后，标记基因tetR被破坏，故导入目的基因的大肠杆菌不能抗四环素，即多数大肠杆菌导入的是pBR322质粒。[答案](1)筛选(鉴别)目的基因是否导入受体细胞(2)如下所示：目的基因—GAATTC—……—GAATTC——CTTAAG—……—CTTAAG—(3)磷酸二酯两种限制酶(BamHⅠ和BglⅡ)切割得到