PCR操作步骤及结果

PCR操作步骤主要内容PCR主要成分PCR操作步骤PCR注意事项PCR操作常见问题讨论PCR主要成分BufferMg2+dNTPsPrimerProbeTaqDNA聚合酶模板BufferPCR的反应buffer一般为10Xbuffer主要作用是提供反应的缓冲体系，维持反应的稳定，给TaqDNA聚合酶提供一个最适酶催反应条件。组成Tris-HCl（pH8.3）100mMKCl500mM有利于引物与模板的退火终浓度为1XMg2+MgCl2（25mM）作用TaqDNA聚合酶活性所必需的，提供离子浓度通常Mg2+浓度范围为1-5mM。Mg2+可促进Taq酶活性影响反应产量，但浓度过高会增加非特异性扩增。对于一种未经实践的PCR反应，可以用0.5mM的递增浓度的Mg2+进行预备实验，选出最适的Mg2+浓度。终浓度为2.5mMdNTP4种脱氧三磷酸核苷酸（25mM）dNTP原液可稀释至25mM并分装，-20℃贮存。终浓度为0.3mMPrimerPCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定，一般PCR反应中的引物终浓度为0.1-0.5µM。引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体，过低则降低产量。终浓度为0.3µM注意：稀释引物最好使用pH8.0TE，可以减弱引物的降解Probe扩增产物片段中间的一段寡核苷酸片段。该探针的5’端标记了一个荧光报告基团FAM（6-carboxyfluorescein，6-羧基荧光素），3’端标记了一条荧光淬灭基团TAMRA（6-carboxy-tetramethyl-damine，6-羧基四甲基若丹明）终浓度为0.2µM注意：稀释引物最好使用pH8.0TE，可以减弱引物的降解TaqDNA聚合酶TaqDNA聚合酶的酶活性单位定义为72℃下，30min，掺入10nmol/LdNTP到核酸中所需的酶量。酶量过多会使产物非特异性增加，过少则使产量降低。终浓度为1.5U注意：为保证酶的活性少受影响，应尽量保持-20℃环境PCR反应步骤反应体系配制反应条件设定上机运行，实时监测结果判读PCR产物验证反应体系小心在冰上加入下列溶液于PCR反应管中（30µl反应体系）：10×buffer(Mg2+free)3µlMgCl2（25mM）3µldNTP（25mM）0.36µl上游引物（10µM）1µl下游引物（10µM）1µl探针（10µM）0.6µlTaq酶（5u/µl）0.3µlddH2O18.74µlcDNA2µl加样顺序模板ddH2O10×bufferMgCl2dNTP引物探针Taq酶扩增条件Stage1:94℃2minStage2:step1:94℃20secstep2:55℃（可变）20secstep3:60℃20secfor45cycles荧光检测设定在stage2-step3复性温度TM-2~5℃Tm=（G+C）×4+（A+T）×2结果判读产物检测将反应产物取3-8µl作2.0％琼脂糖凝胶电泳，定性检测目的基因的扩增水平PCR注意事项无菌操作加样准确，快速（避免二聚体及非特异扩增的形成）避免污染（如cDNA污染，气溶胶污染，唾液污染等）常见问题一、无Ct值（信号）出现：1.反应循环数不够：一般都要在35个循环以上，可根据实验情况增加循环，但高于45个循环会增加过多的背景信号；2.检测荧光信号的步骤有误：一般采用72℃延伸时采集荧光，Taqman方法则一般在退火结束或延伸结束采集信号；3.引物或探针降解：可通过PAGE电泳检测其完整性；4.探针设计不佳：设计探针温度低于引物，造成探针未杂交上而产物已延伸；5.模板量少：对未知浓度的样品应从系列稀释样品的最高浓度做起；6.模板降解：避免样品制备中杂质的引入以及模板反复冻融的情况发生二、Ct值出现过晚：1.反应条件不佳：未最佳反应条件，可重新设计引物或探针，适当降低退火温度，增加镁离子浓度等；2.PCR各种反应成分的降解或加样量不够3.扩增产物片段过长：一般采用100－200bp的扩增长度。三、溶解曲线不止一个主峰1.引物设计不佳：避免二聚体和发夹结构的出现；2.引物浓度不佳：适当调整引物浓度；3.退火温度低：提高退火温度；4.镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度；5.模板中有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的污染，或通过引物设计避免非特异扩增。四、重复性不好1.加样不准确；2.仪器在样品上温度条件有差异，温度均一性不好；3.模板浓度低：样品初始浓度越低，重复性越差，应减少样品的稀释倍数五、扩增效率低：1.反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解；2.反应条件不佳：适当降低退火温度或改为三步扩增法；3.反应体系中有抑制物：一般为模板中引入，应先把模板适当稀释，再加入到体系中，减少抑制物的影响。thanks