荧光分光光度法-

荧光分光光度法基本要求：1.了解荧光光谱法的基本原理和应用特点。2.了解荧光分光光度计的组成以及特点。3.掌握荧光光谱法的定量分析方法。4.了解影响荧光强度的因素。第一节概论回顾：四大类电化学分析法光学分析法色谱分析法其它分析方法原子光谱法分子光谱法X射线光谱法核磁波谱法紫外-可见光分光光度法荧光分光光度法红外吸收光谱法拉曼光谱法荧光粉(俗称夜光粉)，通常分为光致储能夜光粉和带有放射性的夜光粉两类。“荧光粉主要有增白作用，在纸张、包装袋、洗衣粉、塑料、纺织品等上常有应用，这也难怪塑料袋上检出荧光粉。”荧光粉的种类很多，现在市场上常见的就有500多个品种，性状各异，我们常用的Ａ4打印纸上就有荧光粉。一、应用：1.定量分析能产生荧光或能形成荧光配合物的物质。2.简单定性回答“是不是”。二、特点：灵敏度高，比吸收光谱法高10³~104倍。ppb选择性比吸收光谱法好。第二节基本原理一、分子荧光的产生物质吸收光辐射价电子从基态跃到激发态，然后再回到基态释放能量⒈以热能的形式。⒉以光辐射的形式。以光辐射形式释放能量时，发射荧光。这种现象称为光致发光。荧光磷光无辐射跃迁激发态亚稳态（三重态）基态分子的去活化过程：当处于基态单重态（S0）的分子吸收波长为λ1和λ2的辐射后,分别被激发到第一激发单重态（S1*）和第二激发单重态(S2*)的任意振动能级上,而后发生以下过程：振动弛豫:在溶液中，受激的溶质分子与溶剂分子碰撞，而失去过剩的能量，以10-13~10-11s的极快速度，降至同一电子态的最低能级上，这一过程属于无辐射跃迁。内转换:当两个电子能级非常靠近以致其振动能级有重叠时，如第一激发单重态的较高振动能级与第二激发单重态的某一较低振动能级的位能相同，可发生电子由高电子能级以无辐射跃迁的方式跃迁至低能级上。此过程效率高，速度快，一般只需10-13~10-11s。荧光发射:处于激发单重态的最低振动能级的分子，也存在几种可能的去活化过程。若以10-9~10-7s左右的时间发射光量子回到基态的各振动能级，这一过程就有荧光发生。最常见的光致发光：荧光和磷光。两者发光机理不同，寿命不同。荧光寿命10-9～10-6秒，磷光寿命10-3～10秒。荧光可由激发态的分子产生，也可由激发态的原子产生，本章介绍分子荧光。由于荧光的产生由价电子引起，所以，荧光光谱属于电子光谱，其波长范围位于：紫外光区和可见光区。二、激发光谱和发射光谱⒈激发光谱固定荧光波长，以激发光波长对荧光强度(F)所作的光谱曲线。300350400λ(nm)F【例】硫酸奎宁（0.1mol/L硫酸溶液）的激发光谱。⒉发射(荧光)光谱固定激发光波长，以荧光波长对荧光强度F所作的光谱曲线。300350400λ(nm)F【例】蒽（乙醇溶液）的发射光谱。激发光谱和荧光光谱:硫酸奎宁的激发光谱和荧光光谱蒽的激发光谱和荧光光谱荧光物质的最大激发波长和最大荧光波长是鉴定物质的根据，也是定量测定时最灵敏的条件。三、分子荧光与分子结构的关系分子要产生荧光，首先要能吸收紫外光或可见光。能产生荧光的分子具有的结构特点：共轭双键刚性平面多环结构【例】芴具有刚性平面，产生的荧光比联二苯强。CH21具有共轭双键体系的分子：大多数荧光物质都具有芳香环或杂环，因为这些化合物都具有易发生π→π*或n→π*跃迁的电子共轭结构，π电子的非定域性越大，就越容易被激发，分子的荧光效率越大，因此凡能提高π电子共轭程度的结构，如对-苯基化、间-苯基化、乙烯化的作用都会增大荧光的强度。2苯环上取代基的类型：给电子基团。如-OH、-NH2常使荧光增强。与π电子体系互相作用较小的取代基。如-SO3H对分子荧光影响不明显。吸电子基团如-COOH、-CO减弱甚至破坏荧光。•3具有刚性平面结构的分子：刚性的不饱和的平面结构具有较高的荧光效率，分子刚性及共平面性越大，荧光效率越高，酚酞和荧光素比较，荧光素中多一个氧桥，使分子的三个环成一个平面，其共平面性增加，使π电子的共轭度增加，因而荧光素有强烈荧光，而酚酞的荧光很弱。COCOHOHO酚酞荧光素COCOHOHOO四、荧光强度与浓度的关系Φ：量子效率，发射光量子与吸收光量子之比。I0：入射光强度ε：摩尔吸光系数b：光程c：浓度F=2.303ΦI0εbc公式成立前提条件：εbc=A0.05即：当试样浓度较低时（c0.05/εb），C与F方成线性。（如果浓度过高，分子碰撞机会增大，而产生无辐射去激活，造成线性偏离。）第三节荧光分光光度计一、基本结构示意图特点：1．光源方向与检测方向成直角；2．二个单色器。·显示器检测器荧光单色器样品池激发光单色器光源二、主要部件及功能1．光源高压汞蒸气灯，氙灯。能提供紫外光和可见光，光强度比紫外-可见光分光光度计光源大得多。2．激发光单色器作用：提供单波长的激发光。色散元件：棱镜或光栅。出射狭缝宽度可调。3．样品池须用石英材料制成。4．荧光单色器将样品池中的散射光、反射光、杂质荧光等滤掉，只让荧光通过。出射狭缝宽度可调。5．检测器光电转换元件，测定荧光的强度。检测方向与激发光方向垂直：在垂直方向上没有透过光的干扰。由于荧光的强度较弱，一般以光电倍增管作检测器。第四节定量分析一、定量方法一般采用工作直线法。作C—F直线。FC⑴配制一系列待测成分的标准溶液C1C2C3C4C5⑵测出相应的荧光强度F1F2F3F4F5⑶建立工作直线（F→C）①作图法②回归法⑷测量待测样品，得F样①从工作直线上找到待测成分的浓度C样②由回归方程计算出C样定量分析方法校准曲线法：以已知量的标准物质，按试样相同方法处理后，配成一系列不同浓度的标准溶液，在仪器调零后再以浓度最大的标准溶液作基准，调节荧光强度读数为100；然后测出其他标准溶液的相对荧光强度和空白溶液的相对荧光强度；扣除空白值后，以荧光强度为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线；然后将处理后的试样配成一定浓度的溶液，在同一条件下测定其相对荧光强度，扣除空白值后，从校准曲线上求出其含量。分子荧光分析法在检验中的应用尿液中的色胺的测定尿中色胺的含量是色氨酸代谢的一个标志。色胺有天然荧光，激发峰285nm，荧光峰360nm。把尿或组织液的色胺萃取出来，就可直接检测。在0.1~8μg/15mL范围内，荧光强度与色胺浓度呈线性关系。食品中维生素B2的测定:维生素B2（核黄素）在430~440nm蓝光照射下会发出绿色荧光，λem为535nm。它在pH6~7的溶液中荧光强度最大，而在pH11时荧光消失；但在碱性溶液经光线照射发生分解作用或在酸性KMnO4氧化下都会生成荧光强度比维生素B2强得多的黄光素，并可溶于氯仿。利用此性质可提高测定的灵敏度和选择性。H3CH3CNNRNNHOO[O]CCCHCCHCH3CH3CCHCHCH3CCCHCCH2CH2CCH2核黄素黄光素数据处理先预扫描，可以发现这些面巾纸中所含荧光物质一样，都为波长370的荧光物质，然后用370的光来照射，产生荧光，根据拉伯比尔定律，物质荧光物质的强度应该与浓度成线性关系。然后得到一系列的强度：下表是所测荧光物质的含量排名情况名称强度排名欣卉159.141舒洁（Disney）173.672五月花195.893清风（抽式）216.494舒洁（一般）234.545心相印（抽式）243.356洁云（雅致）257.197妮飘（一般）272.158心相印（薄荷）298.899纯点300.910妮飘（hellokitty）妮飘（hellokitty）11妙芙（康师傅）1010.8312思蜜儿（抽式）1000以上13黄色一般草稿纸999.9914A4纸比普通草稿纸多很多15二、影响荧光强度测定的因素1．激发光照射有一些荧光物质若受到强光照射，会发生分解而导致F↓。所以，荧光分光光度计通常在激发光单色器后装配有光闸，在测定时才打开光闸让激发光照射样品池。2．温度温度↑，荧光效率下降，F↓。（因为，温度↑，增加分子间碰撞机会而使能量消耗掉。）4．溶剂有些溶剂会使荧光效率下降，也可能带来干扰荧光。苯胺pH7～12时，发兰色荧光。pH﹤2或PH﹥13时，无荧光。【例】所以，有时需要pH缓冲液控制pH值在适当范围内。3．pH值pH值能改变某些荧光物质的电子构型从而影响荧光强度。灵敏度高。可高达ppb级（10-9），甚至ppt级（10-12）。选择性好，与能产生荧光的物质少有关。三、定量分析的特点及应用思考题一、概念（荧光）激发光谱（荧光）发射光谱原子发射光谱是在原子化过程中自然发射的谱线而原子荧光光谱是用另一波长的谱线去激发原子发出与自然发射不同的另一波长的谱线二、问答题试述分子荧光产生的过程。试述分子荧光强度与浓度的关系式，并说明公式成立的前提条件及原因。分别说明荧光分光光度计两个单色器的作用，以及将光路设计成直角方向的原因。为什么可见光分光光度计的光路是直线方向，而荧光分光光度计的光路是直角方向？