【农药残留分析】-第四章--农药残留测定方法-2

农药残留分析734.2高效液相色谱法4.2.1概述高效液相色谱法(HighPerformanceLiquidChromatography,HPLC)是20世纪60年代末期，在经典液体柱色谱的基础上，引入了气相色谱的理论和技术，并加以改进而发展起来的新型高效分离分析技术。高效液相色谱法是指流动相为液体的色谱技术。在技术上采用高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，实现了分析速度快，分离效率高和操作自动化。高压是高效液相色谱法的突出特点，系统内压力可达15~35MPa。由于流动相流经色谱柱时，柱内填料细密，受到阻力很大，为使流动相迅速通过色谱柱，携带农药样品进入检测室，就必须对流动相施以高压。近年来由于化学键合固定相的出现，高效液相色谱柱效可达3万塔板/m以上（气相色谱填充柱约为2000塔板/m），使分离效率大大提高。高效液相色谱法是现代农药残留分析不可缺少的手段。高效液相色谱仪也是农药残留分析实验室必备的仪器设备。它解决了热稳定性差，难于气化、极性强的农药残留分析问题。高效液相色谱法技术的进步，目前已经不仅仅是气相色谱法的重要补充和多残留分析方法的一种重要选择，而是随着高灵敏、通用型检测器的成功开发并应用，有希望胜任绝大多数农药残留分析任务。1.高效液相色谱法的特点高效由于使用了细粒度的高效填充柱和均匀填充技术，高效液相色谱法分离效率极高，柱效一般可达每米104理论塔板数。近年来出现的微型填充柱（内径为1mm）和毛细管液相色谱柱（内径为0.05mm），柱效超过了每米105理论塔板数，能够实现极为有效的分离。高速由于使用高压泵输送流动相；采用梯度洗脱装置；用检测器在柱后直接检测洗出液成分等原因，HPLC完成分离分析的时间只需几分钟到几十分钟，比经典液相色谱法要快得多。高灵敏度紫外、荧光、电化学等高灵敏度检测器的使用，使HPLC的灵敏度可与气相色谱法媲美。高度自动化现代先进的高效液相色谱仪配有计算机，不仅能够自动处理数据、打印分析结果，而且能够对仪器的全部操作包括流动相的选择、流速、柱温、检测器波长选择，以及进样、梯度洗脱方式等进行程序控制，成为全自动化的仪器。不受分析试样挥发性和相对分子质量的限制，可用于分离高沸点、相对分子质量大、热稳定性差的农药残留及其代谢物的检测。2.基本原理液相色谱法主要被分成两个类型：平面色谱（薄层色谱和纸色谱）和柱色谱。柱色谱农药残留分析74可分为经典柱色谱（低压）和高效液相色谱（高压）。高效液相色谱法又可分为4种主要类型：液固吸附色谱法（LSC）；液液分配色谱法（LLC），主要是键合相色谱法（BPC）；离子交换色谱法（IEC）；空间排阻色谱法（SEC）。与经典的柱色谱法不同，高效液相色谱法采用高压泵，填充微粒固定相的短柱，并且随着组分的流出检测器就可以将样品的浓度记录下来。高效液相色谱法原理与经典的柱色谱法相同，它的进步主要依赖于色谱仪硬件的开发。高压泵能保证当压力不断升高的情况下，流量的精度没有变化，同时有大量的各种类型和规格的色谱柱供选用。高效液相色谱法分离模式可分为4种基本形式（见图4-15）。建立农药残留分析的高效液相色谱方法，选用哪种分离模式取决于被分析农药的结构、性质以及对样品中所含有的干扰物质的分离（见图4-16）。一般讲，高效液相色谱法分析测定农药残留量以液液分配色谱的键合相色谱法最为常用。在这4种分离模式中，根据固定相和流动相相对极性有2种操作方式：正相色谱法(NPC)：固定相的极性比流动相大，非极性组分先流出色谱柱；随着流动相极性的降低，被分析的组分保留时间增加。反相色谱法(RPC)：固定相的极性比流动相小。绝大多数极性组分先流出，随着流动相极性的增加，被分析的组分保留时间延长。反相高效液相色谱法是农药残留分析最常用的一种操作方式。⑴.液固色谱法通常也叫液固吸附色谱法。流动相为液体，固定相为吸附剂，固定相（常用硅胶）通常为没有包裹固定液的液相色谱法。样品中各组分因对固定相表面吸附作用的差异，得以分离和分析。色谱柱内充填固体吸附剂，利用吸附剂表面活性中心进行吸附，试样不进入固定相内部。流动相带着被测组分进入柱子时，吸附剂不仅对不同的组分具有不同的吸附力，而且对流动相分子也具有一定的吸附作用，在吸附剂表面各组分分子之间及各组分分子与流动相分子之间发生吸附竞争，保留值由这两种因素决定。液固吸附色谱法的特点：①.适合可溶于有机溶剂的非离子型化合物的分离，特别是异构体及具有不同极性的取代基的化合物的分离。适合于分析非极性和中性化合物，极性化合物可能在色谱柱上产生不可逆的吸附。②.分析结果重复性差，柱稳定性不好。③.样液固吸附色谱法LSC离子抑制Ionsuppression离子对Ionpair液液分配色谱法LLC(键合相色谱法，BPC)强碱性阴离子SAX强酸性阳离子SCX离子交换色谱法IEC凝胶渗透色谱法GPC凝胶过滤色谱法GFC空间排阻色谱法SEC高效液相色谱法HPLC图4-15高效液相色谱分离模式农药残留分析75品组分吸附在吸附剂的活性部位有变质和损失的可能。这种方法在农药残留分析上应用的相对较少。⑵.液液分配色谱法流动相和固定相都是液体的液相色谱法。利用样品组分在互不相溶的两种液相中分配系数的不同得以实现分离和分析。流动相和固定相为两种互不相溶的液体，两者之间有一个明显的分界面，流动相流过色谱柱时，很大面积上与固定相接触，流动相中的样品组分在两相之间很快进行平衡分配，由于它们在两相之间相对溶解度的差异，会以不同速度流经色谱柱，从而得到分离。液液色谱的特点：①.可使用多种溶剂，固定液抗冲刷能力强，不需要预饱和，再现性能非常稳定。②.分离适用性广，从非极性化合物到极性化合物，都可以作其分离对象。③.为改善分离度可以进行梯度洗脱，能做高精度定量分析。基于这些特点，液液分配色谱法广泛地用于各种样品中农药残留量的分析测定。正相键合相色谱，CN,NH2,有机溶剂反相键合相色谱，C8,有机溶剂和水为流动相液固吸附色谱，硅胶，强极性流动相是试样的分子量2000溶于有机溶剂液固吸附色谱，硅胶，极性溶剂反相键合相色谱，C18,有机溶剂和水为流动相离子对阴离子反相阴离子对离子，C8,C18有机溶剂和水为流动相阴离子交换柱，水为流动相分子大小差别大可离子化吗？很强的脂溶性离子抑制色谱离子交换色谱凝胶渗透色谱反相键合色谱，有机溶剂和水为流动相反相阴离子对离子，C8,C18,有机溶剂和水为流动相凝胶过滤色谱空间排阻色谱否否否否否是是是是阴离子否是阳离子交换柱，水为流动相图4-16液相色谱分离模式选择图农药残留分析76⑶.离子交换色谱法根据离子交换的原理进行分离的液相色谱法。基于作为固定相的离子交换剂（薄膜型离子交换树脂和离子交换键合固定相）上可电离的离子，与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，依样品中不同组分的离子对交换剂具有不同的亲合力而将其分离。离子交换色谱法固定相，主要有以下类型：①.微粒树脂型。②.表面多孔壁。③.硅胶键合相多孔微粒。硅胶骨架上引入各种离子基团，或涂渍键合有机离子交换剂。流动相多采用在水溶液中含有一定离子强度的缓冲液，或与水混溶的有机溶剂。如：甲醇，乙醇，乙腈，二氧六环等。离子交换色谱法特点：①.少数农药品种可以在水溶液中离子化，可以采用电导检测器测定。②.除离子交换外，还可能有吸附和分配作用。⑷.空间排阻色谱法依据分子大小、形状而分离的液相色谱法。用化学惰性的具有网状结构的多孔性物质作固定相，试样组分按分子大小构型进行分离，其作用近似于分子筛效应：试样进入色谱柱后，随流动相在凝胶外部间隙及凝胶孔穴旁流过，体积大的分子不能渗透到凝胶缝隙里去，而较早地被淋洗出来；中等体积分子产生部分渗透作用；小分子可以渗透到孔穴里去，因此较晚被冲洗出来，从而达到分离的目的。水或水溶液作流动相的凝胶色谱称为凝胶过滤色谱；有机溶剂作流动相的凝胶色谱称为凝胶渗透色谱。凝胶色谱固定相有3种类型：①.软性凝胶，如网状交联多聚葡萄糖等。②.半刚性凝胶，如交联聚苯乙烯等。③.刚性凝胶，如多孔硅胶等。流动相为水、缓冲盐溶液、乙醇、四氢呋喃、甲苯、间甲苯酚、N,N–二甲基甲酰胺等。凝胶色谱法特点：①.非离子型的高分子化合物，样品分子量差别愈大愈易分离。②.可测聚合物的分子量分布。③.是一种最稳定的分离手段，不会引起样品变质和损失。3.基本流程高效液相色谱仪由输液系统、进样系统、分离系统、检测系统、控制和数据处理系统组成，其流程如图4-17。1-贮液器2–搅拌、超声脱气器3–梯度洗脱装置4–高压输液泵5–流动相流量显示6–柱前压力表7–输液泵泵头8–过滤器9–阻尼器10–六通进样阀11–色谱柱12–检测器13–记录仪(或数据处理装置)14–回收废液罐图4-17高效液相色谱仪流程示意图农药残留分析77⑴.输液系统一般由贮液器及脱气装置、高压输液泵、梯度洗脱装置构成，其功能是给分离系统提供稳定的能将混合组分分离的高压液体。①.贮液器贮液器一般是玻璃或聚四氟乙烯衬里的塑料容器，容积0.5~2L。有时也用普通的500mL溶剂瓶。流动相中会溶解空气（水更明显）含有的微粒杂质，因此流动相在转入贮液器前必须过滤和脱气。制备好的流动相先过滤后脱气，过滤器采用全玻璃系统，用0.45m水系或有机系的微孔滤膜进行过滤。置于贮液器底部的输液导管，需要安装孔径10m的不锈钢质或铝质或聚四氟乙烯材料的过滤头，该过滤头要定期清洗，特别是在水中的那只，使之保持通畅。流动相脱气是非常重要的，因为流动相中溶解的空气在低压部件，如检测器里会逸出气泡来，气泡的出现会使检测器的噪声加大。若气泡吸入高压泵液缸，会导致压力不稳或停工。脱气有在线和离线两种处理方式。某些商品化贮液器配备有流动相在线脱气装置，如图4-18，装有加热器，温度调节器和磁力搅拌器。离线脱气常用方法有：A.真空脱气法，是应用微型真空泵进行脱气。即在充装流动相的密闭容器中抽真空使溶解气体从流动相中逸出而除去。该方法不适合混合好的流动相脱气，因为长时间的抽真空脱气会改变流动相的配比。B.超声波脱气法，将贮液器超声波振荡5~10min达到脱气的目的。有资料报道，将上述两种方法联合使用脱气效果最佳。C.吹气脱气法，向流动相中吹入氦气，把溶解在流动相中的空气带出。该方法国内采用较少，主要原因是氦气难得，成本高。为防止某种溶剂被氧化，有时可在贮液器液面上加正压充氮气或氦气保护。加正压也有利于流动相进入高压泵液缸。②.高压输液泵由于高效液相色谱柱中填料颗粒较细，通常为5~10m，而且致密。这样通过柱子的流动相会受到很大的阻力，为缩短分析时间，必须使用高压泵，向色谱柱提供流量稳定、重现性好的流动相。对高压输液泵的要求如下：A.流量稳定，输出的流动相脉冲小，流量精度和重复性优于0.3%。1–高压输液泵2–贮液器3–膜过滤器4–塑料膜管线（体积12mL，气体可渗透出来）5–传感器6–控制电路7–电磁阀8–真空泵9–脱气后流动相至过滤器10–脱气单元图4-18高效液相色谱仪在线脱气结构示意图农药残留分析78B.流量范围宽，分析型为0.1~10mL/min范围内连续可调，容易调节。适应微柱，有的高压泵最小体积流量为0.01mL/min。制备型色谱仪所用高压输液泵最大流速可达100mL/min。C.输出压力高，密封性能好。最高输出压力可达40~50MPa。D.泵液缸体积小，方便更换流动相，减少系统平衡时间。E.耐腐蚀性好。多用不锈钢、聚四氟乙烯材料制造，也有用精密陶瓷的。泵的活塞多采用石英杆，单向阀通常是用红宝石或蓝宝石做成。F.具有等梯度和梯度洗脱功能，噪声低且具有安全过压保护装置。G.易于维护和维修。商品高压输液泵有恒流、恒压两种类型。恒流泵使输出的液体流量稳定；而恒压泵使输出的液体压力稳定。恒流泵有往复式柱塞泵、注射泵；恒压泵有气动放大泵。在色谱实际分析操作中，柱系统的阻力由于某些原因可能有所变化，因此恒流泵比恒压泵更优越。在目前高效液相色谱仪上采用最多的是往复柱塞泵（见图4-19）。工作时电动机带动偏心轮转动，偏心轮驱动活塞在液缸内往复运动。柱塞向后运动时，液缸内形成真空，这时出口单向阀关闭