搜索
怨怨（缘）：员猿怨猿原员猿怨苑援［圆］摇再韵晕允匀，阅粤晕陨耘蕴允韵匀晕杂韵晕允，悦粤砸栽耘砸蕴月，藻贼葬造援粤灶藻泽贼澡藻鄄泽蚤葬蚤灶凿怎糟藻泽灶藻怎则燥灶葬造糟藻造造凿藻葬贼澡蚤灶贼澡藻凿藻增藻造燥责蚤灶早则葬贼遭则葬蚤灶增蚤葬贼澡藻蚤灶贼则蚤灶泽蚤糟葬灶凿藻曾贼则蚤灶泽蚤糟葬责燥责贼燥贼蚤糟责葬贼澡憎葬赠泽［允］援晕藻怎则燥泽糟蚤藻灶糟藻，圆园园缘，员猿缘（猿）：愿员缘原愿圆苑援［猿］摇覃怡，谢玉波，唐小曼，等援异丙酚对大鼠空间学习记忆及海马突触结构的影响［允］援广东医学，圆园园怨，猿园（缘）：远怨员原远怨猿援［源］摇阅蒺匀韵韵郧耘砸，阅耘阅耘再晕孕孕援粤责责造蚤糟葬贼蚤燥灶泽燥枣贼澡藻酝燥则则蚤泽憎葬贼藻则皂葬扎藻蚤灶贼澡藻泽贼怎凿赠燥枣造藻葬则灶蚤灶早葬灶凿皂藻皂燥则赠［允］援月则葬蚤灶砸藻泽月则葬蚤灶砸藻泽砸藻增，圆园园员，猿远（员）：远园原怨园援［缘］摇李国才，招伟贤援老年人术后认知功能障碍研究进展［允］援广东医学，圆园园苑，圆愿（缘）：愿猿源原愿猿远援［远］摇砸粤酝酝耘杂郧，杂栽粤砸运耘砸蕴运，匀粤杂耘晕耘阅耘砸砸，藻贼葬造援陨泽燥枣造怎则葬灶藻葬灶葬藻泽贼澡藻泽蚤葬则藻增藻则泽蚤遭造赠蚤皂责则燥增藻泽糟燥早灶蚤贼蚤增藻枣怎灶糟贼蚤燥灶葬灶凿造燥灶早原贼藻则皂责燥贼藻灶贼蚤葬贼蚤燥灶（蕴栽孕）增蚤葬葬灶怎责原则藻早怎造葬贼蚤燥灶蚤灶晕酝阅粤则藻糟藻责贼燥则圆月泽怎遭怎灶蚤贼藻曾责则藻泽泽蚤燥灶［允］援晕藻怎则燥责澡葬则皂葬糟燥造燥早赠，圆园园怨，缘远（猿）：远圆远原远猿远援（收稿日期：圆园员园原园猿原圆圆摇编辑：祝华）摇国家自然科学基金资助项目（编号：猿园怨园员苑怨圆），南方医科大学基础医学院院长基金资助项目（编号：允悦园愿园圆）云蕴粤郧孕怎造造原凿燥憎灶技术筛选蕴粤杂孕原员相互作用蛋白赵亮，丁彦青南方医科大学南方医院病理科（广州缘员园缘员缘）摇摇【摘要】摇目的摇筛选与蕴粤杂孕原员蛋白发生相互作用的蛋白质。方法摇构建携带云蕴粤郧标签的蕴粤杂孕原员融合表达载体，转染人结直肠癌细胞系杂宰源愿园表达云蕴粤郧原蕴粤杂孕原员融合蛋白，用云蕴粤郧原酝圆亲和柱筛选并经杂阅杂原孕粤郧耘分析差异条带，切取差异条带酶解进行质谱鉴定。结果摇成功构建责糟阅晕粤猿原云蕴粤郧原蕴粤杂孕原员真核表达载体，转染杂宰源愿园细胞表达云蕴粤郧原蕴粤杂孕原员融合蛋白，杂阅杂原孕粤郧耘电泳分离得到愿个差异蛋白条带，质谱鉴定蕴粤杂孕原员相互作用蛋白苑愿噪阅葬葡萄糖调控蛋白（郧砸孕苑愿）和热休克同源蛋白苑员（匀杂悦苑员）。结论摇郧砸孕苑愿、匀杂悦苑员均可能与蕴粤杂孕原员存在相互作用，这将为进一步研究蕴粤杂孕原员的功能和作用机制提供依据。【关键词】摇蕴粤杂孕原员；云蕴粤郧孕怎造造原凿燥憎灶；相互作用蛋白；蛋白质组学摇摇蕴粤杂孕原员是一种肌动蛋白结合蛋白和斑联蛋白支架蛋白，在肌动蛋白组装的多个关键部位，如黏着斑、片足、膜皱襞和伪足集中。近年来，越来越多研究证实蕴粤杂孕原员在乳腺癌和卵巢癌等多种恶性肿瘤中高表达，并和肿瘤发生、侵袭和转移密切相关。目前的证据均支持蕴粤杂孕原员作为一种新的肿瘤转移蛋白，然而蕴粤杂孕原员基因是通过什么途径促进结直肠癌发生和转移？回顾文献，目前尚无任何研究涉及蕴粤杂孕原员的分子机制。众所周知，肿瘤的发生、转移的分子基础是一个立体、整体水平上的蛋白质间相互作用的结果，因此，我们选取蕴粤杂孕原员为研究对象，期望通过高通量的“组学”技术，采用云蕴粤郧孕怎造造原凿燥憎灶技术筛选蕴粤杂孕原员相互作用蛋白，从而为深入研究结直肠癌的发生、发展机制提供新的思路，并在此基础上寻找治疗结直肠癌的靶点和筛选能够预测结直肠癌转移及预后的分子标志物。员摇材料与方法员援员摇细胞培养摇人结直肠癌细胞株杂宰源愿园、杂宰远圆园采用含员园豫新生牛血清的砸孕酝陨原员远源园培养基，置猿苑益、缘豫悦韵圆培养箱中培养，取生长状态良好的细胞用于实验。员援圆摇责糟阅晕粤猿原云蕴粤郧载体的构建摇根据云蕴粤郧序列，设计合成圆条互补的阅晕粤链：杂员：缘忆原粤郧悦粤粤郧悦栽栽郧悦悦粤悦悦粤栽郧郧粤悦栽粤悦粤粤粤郧粤悦郧粤栽郧粤悦郧粤悦粤粤郧郧郧栽粤悦悦郧粤郧郧郧粤栽悦悦粤粤原猿忆，杂圆：猿忆原栽悦郧栽栽悦郧粤粤悦郧郧栽郧郧栽粤悦悦栽郧粤栽郧栽栽栽悦栽郧悦栽粤悦栽郧悦栽郧栽栽悦悦悦粤栽郧郧悦栽悦悦栽粤郧郧栽栽原缘忆。其中粤郧悦为保护碱基，粤粤郧悦栽栽为匀蚤灶凿Ⅲ酶切位点，郧悦悦粤悦悦为运燥扎葬噪序列，粤栽郧为翻译起始密码子，郧粤悦栽粤悦粤粤粤郧粤悦郧粤栽郧粤悦郧粤悦粤粤郧郧郧栽粤悦悦为云蕴粤郧序列，郧郧栽粤悦悦为运责灶Ⅰ酶切位点，郧粤郧为保护碱基，郧郧粤栽悦悦为月葬皂匀Ⅰ酶切位点，粤粤为保护碱基。退火该两段序列后，用匀蚤灶凿Ⅲ和月葬皂匀Ⅰ双酶切双链及责糟阅鄄晕粤猿，胶回收酶切片段后，连接载体与云蕴粤郧片段，构建责糟阅晕粤猿原云蕴粤郧载体，测序鉴定。员援猿摇责糟阅晕粤猿原云蕴粤郧原蕴粤杂孕原员真核表达载体的构建摇根据晕悦月陨提供的蕴粤杂孕原员基因序列设计引物，上游引物缘忆端引入月葬皂匀Ⅰ限制性酶切位点，并不含起始密码子粤栽郧，下游缘忆端引入耘糟燥砸Ⅰ酶切位点，以便后续重组质粒的构建。引物序列如下，下划线部分为限制性内切酶位点，斜体部分为酶切保护碱基。孕员：缘忆原悦郧悦郧郧粤栽悦悦粤粤悦悦悦悦粤粤悦栽郧悦郧悦悦悦郧郧原猿忆，孕圆：缘忆原悦悦郧郧粤粤栽栽悦栽悦粤郧粤栽郧郧悦悦栽悦悦粤悦郧栽粤·苑猿圆圆·广东医学摇圆园员园年怨月第猿员卷第员苑期摇郧怎葬灶早凿燥灶早酝藻凿蚤糟葬造允燥怎则灶葬造摇杂藻责援圆园员园，灾燥造援猿员，晕燥援员苑郧栽栽原猿忆。为保证序列扩增的有效性，采用高保真的阅晕粤聚合酶，以杂宰远圆园糟阅晕粤产物为模板，反应条件为：怨源益预变性缘皂蚤灶；怨源益猿园泽，缘苑益猿园泽，苑圆益员皂蚤灶猿园泽，猿园个循环；苑圆益延伸员园皂蚤灶；反应结束后，产物进行员豫琼脂糖凝胶电泳。将孕悦砸回收产物和责糟阅晕粤猿原云蕴粤郧分别用月葬皂匀Ⅰ和耘糟燥砸Ⅰ双酶切后，琼脂糖电泳回收载体大片段和目的片段，连接上述片段，构建责糟阅晕粤猿原云蕴粤郧原蕴粤杂孕原员真核表达载体，转化阅匀缘α感受态细菌，用含粤皂责的蕴月平板筛选阳性克隆，小量抽提质粒，经孕悦砸、酶切及测序鉴定。对测序鉴定序列正确的克隆进行质粒中量抽提。员援源摇带云蕴粤郧标签的蕴粤杂孕原员蛋白质复合物的免疫沉淀摇转染前员凿，将杂宰源愿园细胞以员郾园伊员园远细胞接种于员园皂皂培养皿中，培养至单层细胞融合率达到愿园豫左右进行分别转染责糟阅晕粤猿原云蕴粤郧和责糟阅晕粤猿原云蕴粤郧原蕴粤杂孕原员，瞬时转染源愿澡收集蛋白，用耘在鄄增蚤藻憎栽酝砸藻凿粤晕栽陨原云蕴粤郧酝圆粤枣枣蚤灶蚤贼赠郧藻造做免疫沉淀。步骤如下：轻柔彻底混匀耘在增蚤藻憎栽酝砸藻凿粤晕栽陨原云蕴粤郧酝圆粤枣枣蚤灶蚤贼赠郧藻造，吸取圆园耀缘园μ蕴至冰浴耘孕管中；加入缘园园μ蕴栽月杂用于洗涤平衡月藻葬凿泽，充分震荡混匀后，员园园园园则辕皂蚤灶源益离心猿园泽；小心吸去上清，将耘孕管放置于冰上，重复平衡一次，置于冰上；加入员皂蕴提取的蛋白上清，短暂振荡轻柔混匀，在源益孵育员耀圆澡或过夜；员园园园园则辕皂蚤灶源益离心猿园泽，小心弃去上清；将耘孕管置于冰上，加入缘园园μ蕴栽月杂，短暂振荡轻柔混匀，在源益孵育缘皂蚤灶；员园园园园则辕皂蚤灶源益离心猿园泽，小心弃去上清，放置于冰上，重复洗涤圆次，弃去上清；加入圆园μ蕴员伊杂阅杂上样缓冲液，充分混匀，员园园益水浴煮沸缘皂蚤灶，短暂振荡混匀，员园园园园则辕皂蚤灶源益离心猿园泽，上清原圆园益保存。员援缘摇杂阅杂原孕粤郧耘检测蕴粤杂孕原员相互作用蛋白摇根据待测蛋白的分子量大小，选择合适浓度的杂阅杂原孕粤郧耘。上层浓缩胶浓度为缘豫，下层分离胶浓度为员园豫。每个泳道上样猿园μ早总蛋白，怨园灾电泳源缘皂蚤灶，员圆园灾电泳至溴芬兰到底。电泳完毕后，凝胶用质谱兼容的银染进行染色。员援远摇差异蛋白质条带的酶解及质谱鉴定摇对于杂阅杂原孕粤郧耘胶切取的差异条带，经过常规银染脱色处理后需进行还原和烷基化处理，具体步骤如下：经脱色处理的胶块行员园园豫乙腈（粤悦晕）彻底脱水，每管加入员园园μ蕴员园皂皂燥造辕蕴阅栽栽，置于远园益金属浴中员澡，使蛋白质还原；加入员园园μ蕴缘缘皂皂燥造辕蕴的碘乙酰胺溶液（用缘园皂皂燥造辕蕴晕匀源匀悦韵猿稀释员园伊的储存液），混匀后放入圆缘益金属浴，避光，进行蛋白质巯基的烷基化（葬造鄄噪赠造葬贼蚤燥灶）反应猿园皂蚤灶；员园园μ蕴员园园皂皂燥造辕蕴晕匀源匀悦韵猿，室温反应员缘皂蚤灶；员园园μ蕴员园园豫粤悦晕，缘皂蚤灶后吸弃，室温放置约缘皂蚤灶待乙腈挥发完全；后续胰酶酶解、肽段萃取、在蚤责原栽蚤责柱除盐及质谱分析。圆摇结果圆援员摇责糟阅晕粤猿原云蕴粤郧原蕴粤杂孕原员真核表达载体的构建摇通过引入酶切位点月葬皂匀Ⅰ和耘糟燥砸Ⅰ将蕴粤杂孕原员基因转接入责糟阅晕粤猿原云蕴粤郧多克隆位点处，使蕴粤杂孕原员带上蛋白表位标签云蕴粤郧，孕悦砸鉴定产物为愿园园遭责，重组质粒经月葬皂匀Ⅰ和耘糟燥砸Ⅰ双酶切，电泳检测为缘郾源噪遭和苑愿愿遭责的片段，结果与预期一致（图员），证明真核表达载体责糟阅晕粤猿原云蕴粤郧原蕴粤杂孕原员构建成功。圆援圆摇责糟阅晕粤猿原云蕴粤郧原蕴粤杂孕原员瞬时转染后细胞云蕴粤郧原蕴粤杂孕原员融合蛋白的表达摇将责糟阅晕粤猿原云蕴粤郧和责糟阅晕粤猿原云蕴粤郧原蕴粤杂孕原员重组表达载体分别转染内源性蕴粤杂孕原员低表达的杂宰源愿园细胞中，宰藻泽贼藻则灶遭造燥贼检测转染后云蕴粤郧和蕴粤杂孕原员蛋白表达。可见仅责糟阅晕粤猿原云蕴粤郧原蕴粤杂孕原员转染细胞能表达云粤蕴郧原蕴粤杂孕原员融合蛋白，由于云蕴粤郧标签的引入，其分子量略大于内源性蕴粤杂孕原员蛋白。见图圆。摇粤：孕悦砸产物；月：责糟阅晕粤猿原云蕴粤郧原蕴粤杂孕原员重组质粒的酶切鉴定；悦：质粒缘忆端部分测序结果（下划线序列为蕴粤杂孕原员基因起始密码子）；阅：质粒猿忆端部分测序结果（下划线序列为蕴粤杂孕原员基因终止密码子）图员摇责糟阅晕粤猿原云蕴粤郧原蕴粤杂孕原员重组质粒的鉴定图圆摇宰藻泽贼藻则灶遭造燥贼检测转染后云粤蕴郧原蕴粤杂孕原员融合蛋白表达圆援猿摇蕴粤杂孕原员相互作用蛋白的免疫沉淀摇采用云蕴粤郧·愿猿圆圆·广东医学摇圆园员园年怨月第猿员卷第员苑期摇郧怎葬灶早凿燥灶早酝藻凿蚤糟葬造允燥怎则灶葬造摇杂藻责援圆园员园，灾燥造援猿员，晕燥援员苑原酝圆亲和柱纯化带有云蕴粤郧标签的蕴粤杂孕原员蛋白复合物，结合蛋白洗脱后经杂阅杂原孕粤郧耘电泳分离。空载体责糟阅晕粤猿原云蕴粤郧转染组作为对照。由图猿可见纯化得到清晰的蛋白质条带，且在猿园噪阅葬位置可见明显的云蕴粤郧原贼葬早早藻凿蕴粤杂孕原员蛋白的表达，而对照组相应位置则未见条带，表明云蕴粤郧原酝圆亲和柱结合效率高。分析得到愿个差异蛋白条带，切取全部的差异条带进行酝粤蕴阅陨栽韵云辕栽韵云酝杂鉴定。圆援源摇蕴粤杂孕原员相互作用蛋白的质谱鉴定摇将分析得到的愿个差异条带从制备胶上切下后，通过胶内胰酶消化后抽提得到的肽段用粤责责造蚤藻凿月蚤燥泽赠泽贼藻皂泽（粤月陨）源愿园园酝粤蕴阅陨栽韵云辕栽韵云粤灶葬造赠扎藻则质谱仪分析，将质谱分析得到的肽指纹图谱用阅葬贼葬耘曾责造燥则藻则软件进行处理后用酝葬泽糟燥贼搜索引擎进行数据库搜索。鉴定得到的蛋白质的结果见表员，其中愿个条带共鉴定猿种蛋白质。表员摇差异蛋白质条带的质谱鉴定条带编号数据库登录号蛋白名称得分员孕员员园圆员苑愿噪阅葬葡萄糖调控蛋白源猿远圆孕员员员源圆热休克蛋白苑员猿愿圆猿匝员源愿源苑蕴陨酝和杂匀猿蛋白员圆员员源匝员源愿源苑蕴陨酝和杂匀猿蛋白员源园员缘匝员源愿源苑蕴陨酝和杂匀猿蛋白员圆怨苑远匝员源愿源苑蕴陨酝和杂匀猿蛋白员员圆源苑匝员源愿源苑蕴陨酝和杂匀猿蛋白员猿员愿愿匝员源愿源苑蕴陨酝和杂匀猿蛋白员缘源怨摇摇在成功鉴定的蛋白质条带中，员号条带鉴定为苑愿噪阅葬葡萄糖调控蛋白（苑愿噪阅葬早造怎糟燥泽藻原则藻早怎造葬贼藻凿责则燥贼藻蚤灶责则藻糟怎则泽燥则，郧砸孕苑愿），圆号条带鉴定为热休克同源蛋白苑员（澡藻葬贼泽澡燥糟噪糟燥早灶葬贼藻苑员噪