蛋白质组学及其研究方法(1)..

蛋白质组学及其研究方法2009年11月6日湖南农业大学一、蛋白质组学的相关概念蛋白质组澳大利亚学者Williams和Wilkins于1994年首先提出protein+genome=proteome一个基因组所表达的全套蛋白质一个细胞或一个机体的基因所表达的全部蛋白质蛋白质组是：对应于基因组的所有蛋白质构成的整体，不是局限于一个或几个蛋白质。同一基因组在不同细胞、不同组织中的表达情况各不相同。在空间和时间上动态变化着的整体。蛋白质组学旨在阐明生物体全部蛋白质的表达模式与功能模式从整体的角度分析、鉴定细胞内动态变化的蛋白质的组成、结构、性质、表达水平与修饰状态,了解蛋白质之间、蛋白质与大分子之间的相互作用与联系,揭示蛋白质的功能与细胞生命活动的规律二、蛋白组学的研究内容蛋白质组学的研究内容主要有两个方面：结构蛋白质组学和功能蛋白质组学结构蛋白质组学(Structuralproteomics)主要是蛋白质表达模式的研究，包括蛋白质氨基酸序列分析及空间结构的解析、种类分析及数量确定；功能蛋白质组学(functionalproteomics)主要是蛋白质功能模式的研究，包括蛋白质的功能及蛋白质间的相互作用。蛋白质的各级结构0.50nm0.54nm氢键α-碳原子侧链反平行俯视侧视所以，蛋白质组学研究是对不同时间和空间发挥功能的特定蛋白质群体的研究,从蛋白质水平上探索蛋白质作用模式、功能机理、调节控制以及蛋白质群体内相互作用,为临床诊断、病理研究、药物筛选、新药开发、新陈代谢途径研究等提供理论依据和基础.三、蛋白质组研究的理论基础•从mRNA表达水平并不能预测蛋白表达水平。用基因表达连续分析法(SAGE)研究对数生长期啤酒酵母的80个基因，结果没有发现翻译和转录丰度有明显相关；对某些基因，相同的mRNA丰度翻译成蛋白的量的差异可达50倍；而相等的蛋白量可由丰度相差40倍的mRNA转录而来。这说明转录和翻译水平对蛋白的含量有几乎相同的重要性。•蛋白质的动态修饰和加工并非必须来自基因序列。蛋白质在翻译后可有多种调节方式，如糖基化、磷酸化、异戊二烯化、酰化作用等。此外，许多蛋白质只有与其它分子结合后才有功能，这种修饰是动态的、可逆的。•蛋白质组动态地反映生物系统所处的状态。细胞周期的特定时期、分化的不同阶段、对应的生长和营养状况、温度、应激和病理状态等其相应的蛋白质组之间存在差异。对其中蛋白质合成、降解、加工、修饰的调控过程,只有通过蛋白质的直接分析才能提示。蛋白质组研究的理论基础DNAmRNA蛋白质转录翻译基因蛋白质细胞特异性基因表达生理状态温度应激状态培养条件药物作用数量有限结构相对稳定复杂性多变性直接反应生命现象复杂的调控四、蛋白质组表达模式的研究方法蛋白质组表达模式（expressionprofile）：•研究蛋白质组的组成成分•支撑技术主要有：双向凝胶电泳(2Delectrophoresis)、以质谱(massspectrograph)为代表的蛋白质鉴定技术,以及生物信息学(Bioinformatics)分析。ProteinsampleImageanalysisProteiningelProteinonmembraneProteininsolution2-DPAGEExcisionBlottingElutionPartialdegradationPeptidemixtureMassofproteinN-terminalsequenceMSEdmandegradationPeptidemassfingerprintPeptidesequenceMS/MSdataDatabasesearchingNovelorpreviouslystudiedproteinCharacterizationofpost-translocationmodifications蛋白质组的分析流程（一）蛋白质组研究中的样品制备•通常可采用细胞或组织中的全蛋白质组分进行蛋白质组分析。•也可以进行样品预分级，即将细胞或组织中的全体蛋白质分成不同部分，分别进行研究。•样品预分级主要作用在于提高低丰度蛋白质的上样量和检测灵敏度。样品预分级的主要方法•蛋白质溶解性：可溶性蛋白、非溶性蛋白等•蛋白质定位：膜蛋白、核蛋白等•蛋白质细胞器定位：线粒体、高尔基体、叶绿体等三种常用的植物蛋白提取方法（二）蛋白质组研究中的样品分离•双向凝胶电泳(two-dimensionalelectrophoresis，2-DE)，是目前蛋白质组研究中最有效的分析鉴定技术之一。•由两相组成：第一相：等电聚焦凝胶电泳根据蛋白质电荷差异第二相：SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳根据蛋白质分子量差异二维双向电泳(2Delectrophoresis)基本原理第一向在高压电场下对蛋白质进行等电聚焦(IEF),再在第一向垂直方向上进行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。IEF-focusedproteinsSDS-chargedproteinsinIPGstripSDS-chargedproteinsresolvedaccordingtosizesinSDS-PAGEgel2-DE原理示意图2-DE分析的基本步骤蛋白质溶解变性还原去除蛋白质杂志利用不同pK固定化电解质可配置不同pH范围的凝胶或利用商业化软件设计第一相电泳：IPG－IFE平衡第二相电泳：SDS－PAGE考马斯亮蓝染色、银染色、铜染色样品制备IPG胶制备双相电泳染色2-DE的操作SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGESDSpolyacrylamidegelelectrophoresisSDS带负电荷，破坏蛋白质的氢键、疏水键，使之形成单个亚基。SDS-蛋白质复合物为雪茄形的长椭圆棒，消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异。SDS-蛋白质复合物在凝胶电泳中的迁移率只是蛋白质分子量的函数有关。制胶：试剂分离胶（ml）浓缩胶（ml）1.5MTris-HCl（pH8.9）2.50——30%单体3.501.0010%SDS0.100.10蒸馏水3.846.340.5MTris-HCl（pH6.8）——2.5010%过硫酸铵AP0.050.05四甲基乙二胺TEMED0.010.01样品处理：Loadingbuffer40%甘油溴酚兰SDSβ-巯基乙醇0.5MTris-HCl（pH6.8）50ul样品50ul(2×)LoadingbufferMix950C/5min电泳槽上电极缓冲液下电极缓冲液样品槽上样器阴极阳极电泳方向聚丙烯酰胺凝胶板蛋白质点的染色•凝胶上的蛋白质点染色常用方法有银染法、考马斯亮蓝染色法,另外还采用以下染色试剂:丽春红S、氨基黑、印度墨、35S硫脲银、胶态金、咪唑锌等.•银染法广泛用于双向凝胶电泳分离后蛋白质点的染色,该法灵敏度为4ng,但对质谱测定有干扰,必须先脱银.•考马斯亮蓝染色法可用于胶上或膜上蛋白质点染色,该法操作方便、重现性好,同银染法一样,质谱测定时也必须先脱色.2-DE图像分析技术通过2-DE得到的蛋白质分离图谱，需要经过摄像或扫描转换为以像素为基础的、具有不同灰度强弱和一定边界方向的斑点电脑信号。2-DE获得的蛋白质图谱图像采集斑点检测背景消减获得蛋白质相关信息图像内及图像间的比较2-DE图像分析软件包操作过程：2-DE技术的优缺点•优点：可以同时直观显示数千个蛋白质点；•缺点：极酸、极碱性蛋白质，疏水性蛋白质，极大蛋白质、极小蛋白质以及低丰度蛋白质用此种技术难于有效分离；胶内酶解过程费时、费力，难于与质谱联用实现自动化；丙烯酰胺有神经毒作用。新型非凝胶技术•液相色谱法(liquidchromatography，LC)•毛细管电泳(capillaryelectrophoresis，CE)•液质联用技术（LC-MS/MS）蛋白质混合物直接通过液相色谱分离以代替2-DE的分离，然后进入MS系统获得肽段分子量，再通过串联MS技术，得到部分序列信息，最后通过计算机联网查询、鉴定蛋白质。•多维色谱技术（LC/LC-MS/MS）•多维蛋白质鉴定技术（三）蛋白质组研究中的样品分析鉴定•传统方法：蛋白质微量测序氨基酸组成分析•新型蛋白质鉴定技术——质谱（MS）法基本原理：样品分子离子化后，根据离子间质荷比（m/z）的差异来分离并确定样品的分子量。主要质谱类型•基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtimeofflightmassspectrometry，MALDI-TOFMS）•电喷雾质谱（electrosprayionizationmassspectrometry，ESI-MS）•质谱分析目前是经2D-PAGE分离的蛋白质鉴定的核心技术（四）蛋白质组学研究的生物信息学•2D-PAGE分离的蛋白质经过识别与鉴定后，用图像扫描仪数字化2D-PAGE胶上分离的蛋白质，在蛋白图形工作站上，应用软件，对数字化的蛋白点的分布部位，斑点面积和灰阶、背景过滤、2-DE匹配与比较，建立参考图谱；•对蛋白质鉴定的数据库的搜索是蛋白质组信息学的一大特点；•当用2D-PAGE分离一个蛋白质组后,应用质谱技术测定能够刻划蛋白质属性的各种属性参数(attributeparameter),同时把已有数据库(如OWL或dbEST)中的每一个序列转换成相应属性参数,形成属性化的数据库。然后以此属性参数,形成属性化的蛋白质或核酸数据库。若搜索不到,那可能是新的蛋白质,就须采用传统的生化鉴定。蛋白质数据库•（一）蛋白质序列数据库•（二）蛋白质结构数据库•（三）蛋白质直系同源簇数据库•（四）DIP数据库•瑞士的SWISS-PROT拥有目前世界上最大、种类最多的蛋白质组数据库•目前应用最普遍的数据库是NRDB和dbEST数据库•蛋白质组数据库是蛋白质组研究水平的标志和基础蛋白质数据库的应用•（一）序列比较序列两两对比多序列对比•（二）临床诊断•（三）肿瘤治疗药物的开发五、蛋白质组功能模式的研究方法•（一）蛋白质翻译后修饰的研究•（二）蛋白质相互作用研究技术•蛋白质－蛋白质•蛋白质－核酸间相互作用研究蛋白质-蛋白质相互作用的形式1、蛋白质亚基的聚合2、交叉聚合3、分子识别4、分子的自我装配5、多酶复合体蛋白质之间的相互作用力离子键疏水键二硫键氢键范德华力蛋白质相互作用研究技术蛋白质亲和层析亲和印迹免疫沉淀交联酵母双杂交噬菌体展示生物传感芯片质谱蛋白质工程中的定点诱变技术研究方法传统技术新技术蛋白质-核酸相互作用的研究技术•（一）凝胶滞后试验•（二）滤膜结合•（三）甲基化干扰•（四）DNaseⅠ足纹•（五）核酸-蛋白质杂交谢谢大家！