蛋白质组学常用技术――双向电泳凝胶电泳

1蛋白质组学常用分离技术——双向凝胶电泳2蛋白质研究技术的革命：蛋白质组学蛋白质组学的核心技术是蛋白质的分离技术，而蛋白质分离技术的关键又是对蛋白质总体的提取和分离。提取是从原材料中分离和提取蛋白，分离则是指对提纯的蛋白进行个体间的分离。包括一维分离和二维分离，其中二维凝胶电泳分离技术，又称为2-DE.34双向电泳原理双向电泳法是O′Farrall和Klose分别在1975年根据不同蛋白之间的等电点差异和分子量差异建立的。1.第一向等电聚焦：IEF是根据蛋白质的等电点（pI）的不同而将他们分离的一种电泳技术。蛋白质在环境pH值低于pI时带正电，高于pI值时带负电。在加上电压的情况下，蛋白质会向其最稳定的状态即等电点位置移动。5双向电泳原理2.第二向SDS-PAGE：SDS-PAGE是根据蛋白和多肽的分子量大小将其分离的。它是在含有十二烷基硫酸钠(SDS)的聚丙烯酰胺凝胶中进行的。由于SDS掩蔽了蛋白本身所带的电荷，同时形成了阴离子复合物，使单位质量的蛋白带有大约相等的阴离子电荷。SDS2-D技术操作流程SamplepreparationIEF2-DElectropphoresisImagecapturingandanalisisSitecuttingandenzymolysisMassspectrumanalisis67Samplepreparation样品制备是双向电泳中最关键的一步，质量的好坏将直接影响2-DE结果。尽管处理方法多种多样，但都遵循几个基本的原则：1）尽可能的提高样品蛋白的溶解度，抽提最大量的总蛋白，减少蛋白质的损失；2）减少对蛋白质的人为修饰；3）破坏蛋白质与其他生物大分子的相互作用，并使蛋白质处于完全变性状态。Samplepreparation8一、样品类型1.整体样品整体样品是生物个体小的物种（如微生物），可以整体取样。2.组织样品组织样品常有一个采样的过程，就是从整体部分或整批器官中抽取一定量具有代表性的样品进行试验。3.细胞样品细胞样品包括固体基质中培养的细胞、体外培养悬浮生长的细胞和从组织中分离同类的细胞样品。4.可溶性样品一些可溶性的液体样品，如血清、血浆、尿液脑脊液及细胞和组织的水溶性提取物。Samplepreparation9二、细胞与组织破碎（一）温和裂解法1.渗透裂解；2.冻融裂解；3.去污剂裂解；4.酶裂解法（二)剧烈破碎方法1.超声波裂解；2.费氏压碎器3.研磨法4.机械匀浆5.玻璃珠匀浆10一般样品处理过程1.细胞破碎:避免蛋白降解；2.蛋白质沉淀:去除干扰物质,常用2-Dcleanup试剂盒。11Samplepreparation注意事项：1.加入蛋白酶抑制剂，防止蛋白酶降解目的蛋白；2.操作尽量迅速，尽量在4℃进行；3.除去核酸时最好用超声，尽量避免产生气泡；4.用超速离心除去脂类和多糖干扰；5.尽量避免引入盐离子，可以用水化时加入电极片的方法除去一些盐离子；6.定量要求准确，可以用2-DQuantkit定量，也可用Bradford方法定量。样品分装后-80℃冻存。IEF等电聚焦是利用蛋白质分子或其他两性分子的等电点的不同，在一个稳定的、连续的pH梯度中进行蛋白质的分离和分析。所以利用等电聚焦技术分析的对象只限于蛋白质和两性分子。12IEF13（＋）（－）（－）（＋）高pH高pH低pH低pH等电聚焦电泳进行过程中等电聚焦电泳结束后101022IEF载体两性电解质利用凝胶内的缓冲液在电场作用下,在凝胶内沿电场方向制造一个pH梯度。当蛋白质样品在这样的凝胶上电泳时，每种蛋白质都将迁移至与它的pI相一致的pH处，具有不同pI的各种蛋白质最后都迁移至凝胶中相应的pH处，达到分离的目的。目前应用最多的是聚丙烯酰胺凝胶等电聚胶电泳hemoglobinγ1415固相PH梯度等电聚焦的主要优点：分辨率高可以实现等电点仅有0.01PH单位差别的蛋白质的分离PH梯度稳定克服了载体两性电解质阴极漂移、PH梯度不连续等许多缺点重复性好加样量大可以达到载体两性电解质的10倍。干扰小盐离子对固相PH梯度等电聚焦的影响远小于载体两性电解质的影响第一向等点聚焦系统组件EttanIPGphorⅢ等电聚焦系统包括：1.ImmobilineDryStrip干胶条，含固相pH梯度，通常称为IPG胶条；2.两种胶条固定附件——Manifold胶条槽和固定长度式胶条槽；3.EttanIPGphorⅢ电泳仪，包括一个高压直流电源、珀耳帖（Peltier）固相温控装置、和可同时设定10种IEF方案的程控系统。1617IEFManifold胶条槽可容纳7~24cm长的胶条，最多同时容纳12条，主要可通过三种方式上样：（1）水化上样，通常用于制备和分析电泳，适用于宽范围或窄范围胶条；（2）样本杯上样（阳极或阴极），通常用于分析电泳，适用于碱性或强酸性胶条；（3）纸桥上样（阳极或阴极），通常用于制备电泳，适用于碱性或强酸性胶条。标准胶条槽：采用水化上样，泡涨和上样一次完成。18第一向：聚焦参数设置根据胶条的pH梯度范围、胶条长度及上样量来确定聚焦参数。一般是先主动水化，以24cmpH3-11NL的胶条举例，参数设置如下：30v，12hr；step100v，1hr；gradient1000v，1hr；gradient10000v，2hr；Step10000v，60kvhr；step500v，10hr。19等电聚焦流程图+-第一向：IEF1.用移液器吸取适量制备好的DeStreak水化溶液，至常规胶条槽中，将溶液沿槽道的全长均匀分布。2.从阳极开始（+端），小心揭去ImmobilineDryStrip干胶条的覆盖膜。3.小心地将ImmobilineDryStrip胶条放入盘/槽中。4.用ImmobilineDryStrip覆盖油覆盖胶条。5.设置聚焦时间及梯度电压。2021第二向SDS-PAGESDS-PAGE电泳由四步骤组成：1)灌制凝胶；2)在SDS平衡缓冲液中平衡胶条；3)将平衡好的胶条放置在SDS凝胶上；4)第二向电泳系统的准备并进行电泳。22染色及扫描图像23差异蛋白点分析目前双向电泳面临的挑战灵敏度低线性动态范围窄重复性差定量精确性不够25DIGE技术的发展历史DIGE(Differencegelelectrophoresis)技术最早在1997年由JonMinden实验室的Unlu等提出，后来Amresham成为此技术主要推动者。2002年Gharbis等巧妙的将所有实验组的样品等量混合为内标用在每块胶上。不久，Amresham公司便将内标作为DIGE实验设计核心原则之一，从而使DIGE发展成为更加趋于成熟的体系。26CyDyeDIGE染料优点大小和电荷匹配；pH不明感；光谱不重叠；高灵敏度，高亮度；光稳定性好。27EttanTMDIGE工作流程2D分离Cy5用Typhoon多功能扫描成像系统采集凝胶图像Cy3Cy2用DeCyder全自动差异分析软件进行图像分析和数据定量样品被分别标记后混合样品1用Cy3标记混合内标样品用Cy2标记样品2用Cy5标记28DIGE–内标（Internalstandard）内标为实验中的每张胶上的每个蛋白质都提供了一个参考点。理想情况下，内标中最好含有来源于所有样本的每一个蛋白质。最好的办法就是将所有的样本等量混合来形成内标。C1C2C3T4T5T6Pooledsample(internalstandard)29内标优势在凝胶之间进行精确地定量及精确地点统计分析；增加凝胶之间匹配的可信度；统计分析的灵活性取决于样品之间的联系；将系统误差与生物学误差区分开来。30Whyweusetheinternalstandard?31WorkflowofDIGE32WorkflowofDIGE33WorkflowofDIGE34WorkflowofDIGE35WorkflowofDIGE36WorkflowofDIGE37WorkflowofDIGE38WorkflowofDIGE39WorkflowofDIGE40WorkflowofDIGE42MALDITOF/TOF4800434445Thanks!