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蛋白质组学蛋白质组学的基本概念与原理蛋白质组学研究方法（双向电泳、蛋白质鉴定的质谱方法等）通过本课程的学习，要求同学了解蛋白质组学的基本原理和方法以及国际上蛋白质组学研究的进展简介它是一类重要的生物高分子，参与了生物体内几乎所有的生理功能和代谢过程。Protein什么是蛋白质（protein）蛋白质是由20种氨基酸通过肽键（酰胺键）连接形成的长链分子（肽链），在此基础上，肽链进一步形成二级、三级的空间结构。有的蛋白质还包含辅基成分，如金属铁、锰等。图：肽链的基本结构蛋白质的化学结构和特征蛋白质形成空间结构由一个细胞或者组织的基因组所表达的全部相应的蛋白质，称为蛋白质组。蛋白质组蛋白质组学它是指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门学科。即研究细胞在不同生理或病理条件下蛋白质表达的异同，并对相关蛋白质进行分类和鉴定。目标：研究蛋白质的功能2001年，人类基因组序列图谱初稿的公布，但是，基因只是遗传信息的载体，蛋白质才是生物细胞赖以生存的各种代谢和调控途径的主要执行者。蛋白质组学研究的历史背景和意义30000-40000genes30000genes80%homologous不同生物基因组比较基因组大小(x106)基因数基因密度(基因/bp）状况原核生物1-52,0001/1,500完成30余种酵母136,0001/2,1671996完成线虫9719,0001/5,1051998完成果蝇12013,6001/8,8242000完成小鼠2，400（95%）31，000（99%）完成框架图人2，900（14%）31,000-40,0001/86,000完成框架图生物间蛋白质数的差别基因数差别×101-3蛋白质组可能是生物复杂性进化的基础“失之毫厘，差之千里”翻译后修饰相互作用构象变化翻译后拼接移位胞质胞核蛋白质的多样性生命的“万花筒”为什么进行蛋白质组学研究?mRNA表达蛋白表达(mRN和蛋白水平的相关性一般低于50%)基因顺序无法预测蛋白质的翻译后修饰一个生物系统的动力学状态通过蛋白质组的变化能更好的反映与基因组比较，蛋白质组有如下特点同一个体的基因组不论是在不同的发育阶段或不同种类的细胞里都是一样的；对于不同类型的细胞或同一个细胞在不同的生理状态下，蛋白质组的构成是不同的；基因组蛋白组多样性同一性基因组蛋白组有限性无限性基因组无论大小，其核苷酸的数量和序列是一定的，例如人类基因组长度为32亿个碱基对；对基因组序列的测定是一种“有限”的工作。由于细胞内大部分蛋白质存在翻译后修饰，包括磷酸化、糖基化、酰基化等，很难确定蛋白质组的蛋白质数量；对蛋白质组的蛋白质种类的确定是一种“无限”的工作。基因组蛋白组静态动态一个个体的基因组自个体诞生到死亡，始终保持不变；个体的蛋白质组，作为新陈代谢的主要执行者，在个体的生命活动中却总是变动的；蛋白质组学研究的一个重要任务是找出蛋白质组里发生变化的蛋白质。基因组蛋白组周期性空间性基因组通常位于细胞核内，比较稳定，序列和功能一般不受空间的影响，但是在发育的不同阶段和不同的细胞周期，mRNA的表达是不一样的；不同的蛋白质分布在细胞的不同部位，它们的功能与其空间定位密切相关；许多蛋白质在细胞内不是静止的，他们常常在不同的亚细胞环境里运动而发挥作用；细胞的信号传导和转录调控也常常依赖于蛋白质的变化和运动。基因组蛋白组孤立行为相互作用基因组表达的各种mRNA是彼此孤立的，互不干扰；蛋白质组中的各种蛋白质却是彼此间有着广泛的相互作用；蛋白质互作的研究有两类：第一类是研究蛋白质相互作用的网络，第二类是研究蛋白质复合体组成。基因组蛋白组单一手段多种技术在基因组研究中，DNA测序技术是最基本和最主要的工具，因为基因组的均一性和简单性使得一种单一的技术就能胜任基因组的研究任务。在蛋白质组研究中，需要的研究技术远远不止一种，并且技术的难度也远远大于基因组的研究技术；蛋白质组研究技术可以简单地分为两大类：蛋白质组分离技术，蛋白质组的鉴定技术，其核心是质谱技术。蛋白质组学与基因组学研究互补与互助在质谱测定蛋白质的过程中，离不开对已知基因组的基因数据的比较蛋白质组的数据可以帮助大大提高基因注释的正确率“组学”时代基因组学（Genomics）转录组学（Transcriptomics）蛋白质组学（Proteomics）代谢组学（Metaboliomics）脂类组学（Lipidomics）……系统生物学蛋白质组学分类：细胞蛋白组学(CellProteomics)结构蛋白组学(StructuralProteomics)功能蛋白组学(FunctionalProteomics)磷酸化蛋白组学(Phosphoproteomics)临床蛋白组学(ClinicalProteomics)毒理蛋白组学(Toxicoproteomics)……蛋白质组学基本生物问题翻译后修饰蛋白质-蛋白质相互作用基因组-转录组-蛋白质组临床问题疾病生物标志物-诊断疾病的机理药物目标-治疗确定蛋白质组鉴定定量定位修饰相互作用功能蛋白质组学为什么蛋白质组学研究能够得到开展?新的数据分析技术使蛋白质组学研究切实可行三个关键技术分离技术(2维凝胶电泳技术和2维叶向色谱分离技术)生物质谱鉴定技术(基质辅助激光解析电离技术和电喷雾电离技术)数据处理和图像分析技术(依靠计算机的数据库和数据处理技术以及凝胶电泳图像分析技术)蛋白质组研究细胞蛋白质分离溶解鉴定分析蛋白质的结构和功能1.蛋白质的宽的动力学范围(PI)2.大量的蛋白质是翻译后修饰形成3.蛋白质的种类非常巨大4.蛋白质的4维行为(3D空间位置,时间)蛋白质组研究中的问题蛋白质组学分析技术生物样品(组织、细胞或体液)(SILACtag)数据库搜索信息蛋白质鉴定蛋白质功能研究产品结构研究药物设计疾病诊断2DE,2D-HPLCDIGE染色，图像分析酶解多肽Q-TOF/Q-TRAPMALDI-TOFMALDI-TOF/TOF氨基酸顺序，蛋白质分子量，修饰鉴定提取蛋白iTRAQ-tagICAT-tag反相液相色谱离子交换色谱尺寸排阻色谱酶解蛋白质组学-样品制备SamplepreparationExtractionofproteinfromtissuesandcellsisperhapsthemostcriticalstepinanyproteomicsstratage，becausethisstepinfluencesproteinyield,biologicalactivity,andthestructuralintegrityofthespecifictargetprotein.LexAAnalog(dra0074)IsaRegulatoryProteinThatIsIrrelevanttorecAInduction，J.Biochem.2004,136,787–793ProteomicsAnalysisSamplepreparation↓Proteinseparation↓Processing&ImageAnalysis↓ProteinIdentification↓PTMIdentification↓Proteinquantification本节主要内容(maintopics)(一)样品的制备原则(二)细胞和组织的破碎和蛋白提取方法(三)双向电泳常规样品制备及其改进(四)亚细胞水平(细胞膜)蛋白组的样品制备蛋白质样品制备是蛋白质组研究的第一步，无论后续采用怎样的分离或鉴定手段，样品制备都是关键步骤。什么是样品的全息制备？就是要求样品制备尽可能获得所有的蛋白质，但由于蛋白质种类多、丰度不一和物理化学特性不同等，要达到真正的全息制备是有难度的；Theprincipalaimmusttobereproduciblyachievethehighestdegreeofcellbreakageusingminimaldisruptiveforceswhilemaintainingproteinintegrity.(一)样品制备的原则（principles）基本原则：（1）全息性（keepallofproteininformation）；（2）样品制备的方法还必须与后续的分离或鉴定方法相匹配，如采用双向电泳，需要谨慎使用SDS抽提蛋白质；如果用液相色谱分离，不应该用太多的去污剂和两性电解质(consideringfollowingprotocols/kits)；（3）由于样品来源千差万别，针对不同来源的样品（如细胞样品、动物组织样品、植物样品、体液等），需要采取不同的蛋白质抽提方法(Differentsamples,differentextraction)。影响因素有：pH、温度、机械剪切力、压力和蛋白的水解。尽管有些蛋白的水解不是目标蛋白的水解，但是会影响目标蛋白与其他细胞调节因子的联系。这些影响因素导致的结果就是对目标蛋白的研究没有重复性。结果导致在生物学研究的解释上不统一甚至完全相反。样品制备的影响因素细胞（微生物细胞）Cells动物组织Animaltissues植物组织Planttissues体液Bodyfluid亲水性蛋白；疏水性蛋白；胞质蛋白Cytoplastprotein;膜蛋白Membraneprotein;核蛋白Nucleusprotein;低丰度蛋白Lowabundanceprotein;目标蛋白Targetprotein(二)细胞和组织的破碎和蛋白提取方法celldisruptionandproteinisolationSolvablesample(可溶性样品)蛋白浓度较高的样品，如血浆，血清，可用适量的样品缓冲液稀释后直接上样；(Blood,blood-serum,cerebrospinalfluid,urine,saliva,tear,bile)蛋白质浓度较低的或含较高盐浓度的样品，如分泌蛋白，在分离前用硫酸铵沉淀、透析或层析法脱盐，再用冻干、对聚乙二醇的透析或用TCA(三氯醋酸)／丙酮沉淀的方法进行浓缩。分泌蛋白质（细菌）的样品制备：A.细菌培养到一定密度后，4oC下20,000g离心15min;B.取上清，0.45μm滤膜过滤，去除残余的细菌；C.滤液中加入预冷的25%TCA沉淀蛋白质，冰浴15min;D.4oC离心10minE.10mL丙酮重悬沉淀，清洗2次；F.冻干沉淀分泌蛋白质制备应注意：蛋白质的浓缩和除盐避免培养基中成分对分泌蛋白质的覆盖；确保获得足够实验需要的蛋白量；Samplefromtissue(组织样品)一般的固体组织样品常在溶解缓冲液中破碎，最好的方法是在组织冷冻及液氮温度的条件下破碎，如研钵和匀浆器处理；特殊的问题：如何解决样品的异质性问题？（一个组织的不同类型细胞的收集问题）１）基于免疫亲和技术的选择；２）微量切割技术，如激光俘获微切割技术(LCM),选择细胞；TissuesGrinding-UltrasonicationModeratelyharshVigorousDouncehomogenizer/Potter-Elvehjemhomogenizer/WaringBlendorHomogenizer--cellsbrokenbyshearforces--softanimaltissuesmostanimalplanttissuesModeratelyharsh-植物组织样品的制备1)TCA/丙酮法用TCA/丙酮溶液沉淀蛋白质,然后用裂解液溶解沉淀.优点:提高了蛋白提取量;去除次级代谢产物的干扰;使体内蛋白酶失活,避免蛋白降解;缺点:由于不充分的沉淀和溶解而选择性地丢失某些蛋白质.以拟南芥幼叶为例,具体步骤A.称取新鲜的嫩叶200mg,洗净;B.液氮速冻,研磨,加含0.07%巯基乙醇,10%TCA的丙酮溶液,低温研磨45min;C.离心15min,用0.07%巯基乙醇,1mMPMSF和2mMEDTA清洗沉淀,冻干;D.每10mg冻干粉中