第一章---基因工程概述

基因工程只有想不到的没有办不到的基因工程不是发现，而是创造。第一节基因工程概述基因工程又称为重组DNA技术，指在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞并使重组基因在受体细胞中表达，产生人类需要的基因产物的技术。基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程的别名操作环境操作对象操作水平基本过程结果实质DNA重组技术生物体外基因DNA分子（基因）水平人类需要的基因产物剪切→拼接→导入→表达基因重组基因工程的诞生和发展证明DNA是遗传物质发现DNA双螺旋结构破译遗传密码限制性核酸内切酶的发现DNA连接酶的发现逆转录酶的发现质粒等载体的发现基因工程的诞生1944，艾弗里1953，沃森和克里克1963，尼伦贝格1970，阿尔伯、内森斯、史密斯基因工程的诞生•1973年，美国科学家科恩（S.N.Cohen）等将两种不同来源的DNA分子进行体外重组,并首次实现了在大肠杆菌中的表达,创立了定向改造生物的新技术—基因工程。•1973年，科恩和博耶将两个不同的质粒（一个是抗四环素质粒，另一个是抗链霉素质粒）拼接在一起，组成嵌合质粒，并将其导入大肠杆菌，当该重组质粒进入大肠杆菌体内后，这些大肠杆菌能抵抗两种药物，而且这种大肠杆菌的后代都具有双重抗药性。pSC101抗四环素pR6-5抗卡那霉素DNA连接酶重组DNA分子EcoRI抗卡那霉素基因培养平皿卡那霉素基因四环素\卡那霉素基因大肠杆菌四环素平板基因工程诞生的故事历史长河基因工程大事记•1973年，体外重组的基因首次实现在大肠杆菌中的表达•1977年，生长激素抑制素在大肠杆菌中成功表达•1978年，人胰岛素在大肠杆菌中成功合成•1979年，人生长激素在大肠杆菌中得以表达•1980年，人干扰素在大肠杆菌中成功表达•1982年，巨型小鼠培育成功巨型小鼠和荧光小鼠分别植入了“大鼠生长激素基因”和“水母荧光基因”。基因工程的实施至少要有四个必要条件供体基因受体细胞载体工具酶基因工程的工具—酶与载体•分子手术刀——限制性核酸内切酶。•分子针线（分子缝合针）—DNA连接酶。•基因的运输工具（分子运输车）—载体。限制性核酸内切酶限制性内切酶是在生物体(主要是微生物)内的一种酶，能将外来的DNA切断，由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性核酸内切酶。即每种限制性内切酶只能识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点上切割DNA分子。特点：特异性。举例：EcoR1限制酶、Sma1限制酶限制性内切酶作用示意图黏性末端磷酸二酯键不同的限制性核酸内切酶知识海洋平(口)末端回文序列•要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？要切两个切口，产生四个黏性末端。•如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？会产生相同的黏性末端，然后让两者的黏性末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。AATGAATTCGATGATTCCGTAATGAATTCGATTACTTAAGCTACTAAGGCATTACTTAAGGCDNA连接酶（DNAligase）同一种连接的部位：用DNA连接酶连接两个相同的黏性未端要连接几个磷酸二酯键？磷酸二酯键，不是氢键。磷酸二酯键连接酶的种类E.coliDNA连接酶T4DNA连接酶30•外源基因(如大鼠生长激素基因)怎样才能导入受体细胞(如小鼠受精卵)？导入过程需要运输工具——载体。•载体的作用有哪些？作用一：作为运载工具，将外源基因转移到受体细胞中去。作用二：利用载体在受体细胞内，对外源基因进行大量复制。•作为载体必须具备哪些条件？1）能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。2）具多个限制酶切点，以便与外源基因连接。3）具有某些标记基因，便于进行筛选。如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等。载体常用的载体主要有两类：1）细菌细胞质的质粒2）噬菌体或某些动植物病毒质粒的特点•细胞染色体外能自主复制的小型环状DNA分子；•质粒是基因工程中最早应用也是最常用的载体；•存在于许多细菌及酵母菌等生物中；•质粒的存在对宿主细胞的生存无影响；•质粒的复制只能在宿主细胞内完成。最常用的质粒是大肠杆菌的质粒，其中常含有抗药基因，如四环素等标记基因。最简单的质粒载体必需包括3部分：复制区（含复制原点）目的基因插入点遗传标记基因1.下列有关基因工程中限制性核酸内切酶的描述，错误的是（）A.一种限制性核酸内切酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列B.限制性核酸内切酶的活性受温度的影响C.限制性核酸内切酶能识别和切割RNAD.限制性核酸内切酶可从原核生物中提取C反馈练习2.下列关于DNA连接酶作用的叙述，正确的是（）A.将单个核苷酸加到某DNA片段末端，形成磷酸二酯键B.将断开的两个DNA片段的骨架连接起来，重新形成磷酸二酯键C.连接两条DNA链上碱基之间的氢键D.只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来，而不能将双链DNA片段平末端之间进行连接B3.下表关于基因工程中有关基因操作的名词及对应的内容，正确的组合是（）供体剪刀针线载体受体A质粒限制性核酸内切酶DNA连接酶提供目的基因的生物大肠杆菌等B提供目的基因的生物DNA连接酶限制性核酸内切酶质粒大肠杆菌等C提供目的基因的生物限制性核酸内切酶DNA连接酶质粒大肠杆菌等D大肠杆菌等DNA连接酶限制性核酸内切酶提供目的基因的生物质粒C4542基因工程的一般步骤1.获得目的基因（目的基因的获取）2.制备重组DNA分子（基因表达载体的构建）3.转化受体细胞(将目的基因导入受体细胞)4.外源基因阳性克隆的鉴定和筛选（筛选出获得目的基因的受体细胞、培养重组细胞）5.目的基因的表达（目的基因的检测和鉴定）第一步：获取目的基因方法：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库（genelibrary）基因组文库cDNA文库1.从基因文库中获取目的基因。基因文库的构建模式图通过对受体菌的培养而储存基因2.利用PCR技术扩增目的基因PCR（polymerasechainreaction）:聚合酶链式反应.是以DNA变性、复制的某些特性为原理设计的.1988，K.Mulllis莫里斯发明。前提条件是必须对目的基因有一定的了解，需要设计引物。3.通过化学方法直接人工合成高温变性低温退火(复性)中温延伸第二步：制备重组DNA分子（基因表达载体的构建）核心限制性核酸内切酶需要哪两种工具？DNA连接酶总结：表达载体需由哪几部分组成•复制原点•启动子•目的基因•终止子•标记基因第三步：转化受体细胞（将目的基因导入受体细胞）将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞目的基因进入受体细胞，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化（ruansformation）将目的基因导入植物细胞的方法农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法土壤农杆菌转化法示意图P17积极思维抗软化番茄是如何培育出来的？•普通番茄为什么不耐贮藏？•说出抗软化番茄的培育过程。将目的基因导入动物细胞的方法显微注射法1982年，美国，帕米特（R.Palmiter）超级小鼠将目的基因导入微生物细胞方法宿主细胞（大肠杆菌）感受态细胞（大肠杆菌）Ca2+•基因工程中常用的宿主细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌、霉菌、植物细胞、昆虫细胞及哺乳动物细胞等。将目的基因导入受体细胞扩增第四步：目的基因的检测与鉴定•首先：•其次：•最后：•还要：要检测转基因生物的DNA上是否插入目的基因DNA分子杂交技术分子探针检测目的基因是否转录出mRNA检测目的基因是否翻译出蛋白质个体生物学水平的鉴定DNA分子杂交技术•基因探针：核酸分子探针是指特定的已知核酸片段，能与互补核酸序列退火杂交，用于对待测核酸样品中特定基因顺序的探测。•满足：（1）必须是单链，（2）带有容易被检测出来的标记物。•基因探针的标记和工作程序作为探针的核酸样品必须进行标记才能被检测。常用放射性同位素有32P、5S、125I及3H等标记。标记好的探针即可用于和待测样品DNA进行杂交反应，然后通过放射自显影来检测。第五步：目的基因的表达使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物。1.下列有关基因工程技术的叙述，正确的是（）A.重组DNA技术所用的工具酶是限制性核酸内切酶、连接酶和载体B.所有的限制性核酸内切酶都只能识别同一种特定的核苷酸序列C.选用细菌作为重组质粒的受体细胞是因为细菌繁殖快D.只要目的基因进入受体细胞就能实现表达反馈练习23．（2010江苏高考，27题，8分）下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图l、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请回答下列问题：（1）一个图1所示的质粒分子经SmaⅠ切割前后，分别含有个游离的磷酸基团。0、2（2）若对图中质粒进行改造，插入的SmaⅠ酶切位点越多，质粒的热稳定性越。（3）用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用SmaⅠ切割，原因是。（4）与只使用EcoRI相比较，使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于可以防止。（5）为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入酶。（6）重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了。（7）为了从cDNA文库中分离获取蔗糖转运蛋白基因，将重组质粒导入丧失吸收蔗糖能力的大肠杆菌突变体，然后在的培养基中培养，以完成目的基因表达的初步检测。高SmaⅠ破坏质粒上的抗性基因和外源DNA中的目的基因质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化DNA连接鉴别和筛选含有目的基因的细胞蔗糖为唯一含碳营养物质基因工程的应用基因工程技术已经在医学、工业、农业等各个领域得到了广泛的应用。（1）在医学上的应用基因工程被用于大量生产过去难以得到或几乎不可能得到的蛋白质－肽类药物。基因工程疫苗乙型肝炎是危害我国人民健康的严重疾病，我国乙肝病毒携带者1亿1千万人，其中40％左右的慢性肝炎可能发展成为肝硬化和原发肝癌。以往乙肝疫苗是从人血清中提取，基因工程乙肝疫苗的研制成功，不仅有巨大的经济效益，而且有巨大的社会效益。基因工程乙肝疫苗是我国正式批准投放市场的第一种高技术疫苗，在20多项指标上达到国际先进水平，获国家科技进步一等奖。继乙肝疫苗之后，我国又研制成功了痢疾、霍乱等数种基因工程疫苗，并经国家批准进入临床试验。基因工程药物干扰素是一种广谱的抗病毒和抗肿瘤高技术药物，对防治病毒性肝炎和恶性肿瘤有重要的作用。现已有了3个品种的基因工程干扰素获得国家新药证书，开始大批量生产。除此之外，我国还研制成功了肝癌导向药物（生物炸弹）、系列恶性肿瘤辅助治疗药物等十余种基因工程药物，有些已获试生产文号或进入中试开发阶段。胰岛素1000磅牛胰10克胰岛素200升发酵液10克胰岛素干扰素1200升人血1升发酵液2－3万美元/病人200－300美元/病人用于提高奶酪产量生产奶酪的凝乳酶传统上来自哺乳小牛的胃。现在可以通过基因工程办法，用酵母生产凝乳酶，大量用于奶酪制造。哺乳小牛凝乳酶基因胃转入啤酒酵母凝乳酶凝乳酶制造奶酪（2）转基因动物和植物转基因动物首先在小鼠获得成功。现在转基因动物技术已用于牛、羊，使得从牛/羊奶中可以生产蛋白质药物。称为“乳腺反应器”工程。转基因植物亦已在大田中广为播把大鼠生长因子转入小鼠得到巨大型的转基因小鼠。核移植，就是利用一个动物体细胞的细胞核（供体核）来取代受精或未受精卵中的细胞核，形成一个重建的“合子”。克隆原意是无性繁殖。克隆动物就是不经过生殖细胞的受精过程而直接由体细胞获得新的动物个体，这个新个体是原核供体动物的拷贝。多莉(Dolly)：1996.7.5－2003.2.14277次乳腺细胞核移植实验；获得29个发育为8细胞的“胚”；13头代孕母亲；1996年7月5日，羊羔6LL3，被命名为“多莉”。几点说明——•任何一个高等动物的细胞或个