蛋白质浓度测定——考马斯亮蓝染色法(实验报告)

生物化学实验报告——蛋白质浓度测定:考马斯亮蓝染色法-1-蛋白质浓度测定——考马斯亮蓝染色法（实验报告）实验日期：2015年4月28日实验温度：室温实验地点：生物化学与遗传学实验室指导老师：***班级：2013级生物技术1班姓名：**学号：********I.实验目的1.学习考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度的原理和方法；2.熟悉蛋白质含量测定的影响因素。II.实验原理考马斯亮蓝是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的，这是一种迅速、可靠的通过染色法测定溶液中蛋白质浓度的方法。考马斯亮蓝G-250在酸性游离状态下呈棕红色，最大吸收波长465nm，与蛋白质结合后变为蓝色，最大吸收波长595nm，在一定的蛋白质浓度范围内吸光度与蛋白质含量成正比。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合，反应2min即可到达平衡，复合物在室温下1h内保持稳定。蛋白质—考马斯亮蓝G-250复合物吸光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，可测微克级蛋白质含量。III.实验试剂与仪器1.实验试剂生物化学实验报告——蛋白质浓度测定:考马斯亮蓝染色法-2-(1)100μg/mL标准蛋白质溶液5mg酪蛋白溶于50mL的0.1mol/L氢氧化钠溶液。(2)考马斯亮蓝G-250试剂50mg考马斯亮蓝G-250溶于25mL的95%乙醇中，加85%的磷酸50mL，蒸馏水定容至500mL。(3)正常人血浆。2.实验器材可见分光光度计，100μL微量移液器16支，5mL刻度吸管8支，中试管。IV.实验操作步骤1.绘制标准曲线取中试管8支，按下表加入各种试剂混匀，室温放置5min后即可比色。以“0”号管为空白，记录于下表，绘制标准曲线。标准曲线绘制数据表012345样1样2标准蛋白μg数020406080100mL012345样品1样品2标准蛋白质溶液00.20.40.60.81.0--血浆00.80.60.40.200.40.40.1mol/LNaOH------0.60.6考马斯亮蓝试剂各5.0生物化学实验报告——蛋白质浓度测定:考马斯亮蓝染色法-3-A59500.5170.8050.9411.1571.1921.4651.4402.样品测定中试管2支分别加未知浓度蛋白质（或人正常血浆）0.4mL，各加5.0mL考马斯亮蓝试剂摇匀，室温放置5min，以“0”号管为空白比色，以所测A595于标准曲线查蛋白质含量。V.实验结果分析结果分析：实验未能达到预期的一条直线，原因可能为：①血浆样本放置时间太久，蛋白质变性；②实验比色杯由于使用后未及时擦洗，导致比色误差（原因小）；③人为操作不当，导致误差。VI.注意事项1.考马斯亮蓝试剂加入后室温放置5～20min内比色，布的超过1h；2.蛋白质-染料复合物少量附于比色杯，不影响测定，生物化学实验报告——蛋白质浓度测定:考马斯亮蓝染色法-4-可用乙醇洗净。