散射免疫比浊法

第六章免疫比浊分析目录第一节免疫比浊技术原理第二节自动化免疫比浊分析第三节小结第一节免疫比浊技术原理免疫比浊技术分类：透射免疫比浊法（turbidimetricimmunoassay）散射免疫比浊法（nephelometryimmunoassay）速率散射比浊法终点散射比浊法一、透射免疫比浊法当一定波长的光通过抗原抗体反应形成的免疫复合物时会因为反射和吸收而减弱，一定范围内，透射光被吸收的量与复合物的量呈正相关关系，而复合物的量与抗原抗体量为一定的函数关系。（一）基本原理在抗原或抗体量一定的条件下，可以利用比浊仪在光源的光路方向上测定透射光强度与入射光强度的比值或吸光度，来判断待测抗原的量，这种方法称为透射比浊法。透射免疫比浊法光路图待测的抗原抗体复合物分子量足够大。抗原抗体复合物数量足够多。具有充分的反应时间。高亲和力的抗体，并保证抗体过量。（二）技术要求透射免疫比浊法的灵敏度是单向琼脂扩散方法的5～10倍，但其与标记免疫分析技术相比还不够高。因此，透射比浊类的自动分析仪用于免疫测定已趋减少，该测定原理主要用于生化分析仪。（三）方法学评价抗原抗体反应曲线二、散射免疫比浊法散射比浊法是指一定波长的光沿水平轴照射，通过溶液时遇到其中的抗原抗体复合物，光线被粒子颗粒折射而发生偏转，产生散射光。（一）基本原理其中光线偏转的角度与发射光的波长和抗原抗体复合物的大小和多少密切相关。散射光的强度与复合物的含量成正比，即待测的抗原越多，形成的复合物越多，散射光就越强。透射浊度法和散射浊度法的光路应选择适当的光源强度、反应时间、测量角度及光源的波长。另外，要注意保证抗原浓度合适。此外，还要选择适宜的离子强度、pH值等。（二）技术要求散射免疫比浊法是当今免疫化学分析中比较有优势的方法。可以实现自动化管理，但用于免疫沉淀反应有很多缺陷，如因为是一次性测定光吸收值，没有考虑单个待测样本的散射效果，可能使测定结果不准确。（三）方法学评价测定的时间依然较长，且随时间延长，抗原抗体复合物有重新结合的趋势，可影响散射值的变化及存在反应本底，在微量测定时，本底的干扰是影响测定准确性的重要因素。三、速率免疫比浊法该法是抗原抗体结合反应的一种动态测定方法。将抗原抗体的沉淀反应与散射比浊分析相结合，对单位时间内抗原和抗体结合形成复合物的速度进行动力学测定即为速率免疫比浊法。（一）基本原理当抗体的浓度固定于一定范围时，速度峰值的高低与抗原的含量成正比，随着时间的延长，免疫复合物的量逐渐增多，抗原抗体结合速度的峰值在一定的时间出现。通过微机处理即可得到待测蛋白成份的含量。累计时间复合物产生总量产生速率510152025303540455055608132560150230300360415450480500—512359080706055453020抗原抗体复合物形成时间与速率的关系速率散射比浊法峰值出现的时间与抗体浓度及纯度直接相关，需选用抗体纯度及亲和力交高的试剂。此外，要保证待测样本血清的性状符合要求，如严重脂血等即为不合格样本。（二）技术要求该法具有快速、敏感度及精密度高的特点，其最大优点在于快速，检测不必等到抗原抗体达到平衡，大大节省反应时间，每小时可检测标本数十份；敏感度高，最小检出量达微克/升水平。（三）方法学评价四、免疫胶乳比浊法将抗体吸附在大小适中、均匀一致的胶乳颗粒上，制成致敏的胶乳颗粒，当遇到相应抗原时，发生交联反应，形成抗原抗体复合物，胶乳颗粒发生凝集。（一）基本原理单个胶乳颗粒在入射光波长之内并不阻碍光线透过，两个及其两个以上胶乳颗粒凝聚时则使透过的光减少，其减少的程度与胶乳颗粒凝聚的程度呈正比，即与待测抗原量呈正比，由此可检测样本中的特定抗原含量。胶乳颗粒的均一性将直接影响光散射作用，影响检测结果，因此需要选择均匀一致的胶乳颗粒。此外，试剂需要加保护剂以提高其稳定性，所用器皿要洁净，避免杂质微粒的干扰。（二）技术要求该法敏感度高，试剂稳定，个体免疫复合物对结果影响也小，因此结果稳定、可靠，特异性好，精确度高，且不需要特殊的仪器设备，一般分光光度计、自动化生化分析仪或散射比浊仪均可使用。返回章目录（三）方法学评价（一）BN特种蛋白分析测定系统该系统的测定方法是透射免疫比浊法的一种改良。以发光二极管作为光源，检测前向角13～24度的散射光，然后利用硅化光电二极管接收散射光信号，经过微电脑处理，与标准曲线进行比较，最后转换成待检物质的浓度。第二节自动化免疫比浊分析一、主流免疫比浊设备概况1.测定原理系统由分析仪、计算机、条码读取器、打印机四部分组成，其中分析仪是主要组成部分，包括散射测浊仪、自动加样系统、运输装置和比色杯装置。2.仪器基本组成BN100、BNⅡ特种蛋白分析分析系统本系统属于速率散射比浊分析法，在抗体过量的前提下，光束通过抗原抗体复合物时所产生的散射光速率变化大小与抗原浓度成正比。速率的峰值通过电脑处理系统转换成待测抗原的浓度。1.测定原理（二）ARRAY分析系统ARRAY系统由分析仪、电脑处理系统、打印机构成，其主要构成部分为分析仪，由加液系统、散射测浊仪、40孔样本转盘、20孔试剂转盘、软盘驱动器等组成。2.仪器基本组成Array360、IMMAGE特种蛋白分析分析系统二、免疫比浊分析的主要影响因素1．抗原抗体比例抗原抗体比例要适当。2．抗体的纯度与效价诊断试剂应尽可能选择高纯度与高效价的抗体。3．免疫复合物的大小及稳定性溶液中免疫复合物颗粒的分散度尽可能相同，颗粒应该不容易相互聚集。4．增聚剂利用增聚剂破坏抗原抗体的水化层，促进反应的进行。5.离子强度PBS是较好的反应液。返回章目录小结经典的免疫沉淀反应通常是在抗原抗体反应的终点进行结果判断，存在操作繁琐、费时、敏感度低及难以自动化等缺陷。自动化免疫比浊分析仪器的问世解决了以上的诸多问题。目前，透射免疫比浊法和散射免疫比浊等方法已常规运用于临床特定体液蛋白质的检测，相关仪器已广泛应用于国内各级医院，成为临床免疫检测的重要手段之一。返回章目录雅安职业技术学院谢谢！