搜索
mtDNA提取流程（1）将待测组织充分切碎（碎片大小：脾脏组织≤10mg、其他组织≤25mg），取样品25mg移入微型离心管。（2）加入180μLBufferATL、20μLProteinaseK、缓慢充分混匀，置于56℃恒温水浴直到完全溶解（水浴期间间隔摇晃混合）。在开始下一步前摇晃混合15s。（3）加入200μLBufferAL，充分混合（血液样品需56℃恒温水浴10min）。（4）加入200μL无水乙醇，混合均匀。（5）将混合溶液移至2mL收集管中的滤管里，6000xg条件离心1min，取出滤管，扔掉收集管。（6）将滤管放入新的收集管中，加入500μLBufferAW1,6000xg条件离心1min，取出滤管，扔掉收集管。（7）将滤管放入新的收集管中，加入500μLBufferAW2,20000xg条件离心3min，取出滤管，扔掉收集管。（8）将滤管放入新的微型离心管（1.5-2mL）。（9）向滤管中心滴加200μL（100μL）BufferAE洗涤DNA，室温放置1min。6000xg条件离心1min。（10）重复一边上述步骤，增大DNA产率（重复一遍即可）。理论25mg原料大概能提取10-20μgDNA.注：摇晃混合和拿起时一定要轻慢，防止DNA断裂。琼脂糖电泳步骤1.准备电泳槽：将有机玻璃的电泳凝胶床洗净晾干，插上样品梳。2.琼脂糖凝胶的制备：称取琼脂糖溶解在电泳缓冲液中（1%的琼脂糖含量），置微波炉或沸水浴中加热至完全溶化（不要加热至沸腾），取出摇匀。3.灌胶：将冷却60℃的琼脂糖溶液轻轻倒入电泳槽水平板上（厚度不超过0.5cm）。待琼脂糖胶凝固后，在电泳槽内加入电泳缓冲液，然后拔出梳子。5.加样：将DNA样品与加样缓冲液按5：1混匀后（取10µLDNA样液与2µL电泳载样缓或5µLDNA样液与1µL电泳载样缓冲液混匀，用移液枪将混合液加到样品槽中，每槽加10-20μL，记录样品的点样次序和加样量。6.电泳：安装好电极导线，点样孔一端接负极，另一端接正极，打开电源，调电压至80V（4V·cm-1），电泳2h，当移到距凝胶前沿1-2cm时，停止电泳。7.染色和观察：取出凝胶，放在260nm的紫外灯下观察，有橙红色荧光条带的位置，即为DNA条带，或在紫外灯下照相记录电泳图谱。短期贮存：4℃或-20℃存放于TE（Tris和EDTA）缓冲液中。TE缓冲液的PH与DNA贮存有关，PH为8时，可减少DNA脱氨反应，PH低于7.0时DNA容易变性。长期贮存：TE缓冲液中-70℃保存数年；在DNA溶液中加一滴氯仿可有效防止细菌和核酸的污染。