线粒体疾病的分子生物学检验

线粒体疾病的分子生物学检验Moleculardiagnosisformitochondrialrelateddisorders线粒体（Mitochondrion）21.真核细胞中的细胞器，二分裂方式进行新陈代谢，平均寿命10天2.多数细胞含几个到几千个线粒体3.每个线粒体含2-10线粒体DNA（mtDNA）3线粒体功能MitochondrialDisease.Chest2001;120:634–648ATP能量代谢其他功能•储存钙离子•调节膜电位并控制细胞程序性死亡•细胞增殖与细胞代谢的调控•合成胆固醇及某些血红素•产热——Wikipedia线粒体病Mitochondrialdisorders发现-1962年，Lufe等发现一位年轻的瑞典妇女伴有异常增高的基础代谢率，同时伴有线粒体结构的异常和氧化磷酸化功能的异常。直到1988年，Wallace等报道了首例由线粒体DNA突变引起的人类疾病，明确了mtDNA突变可引起人类疾病。定义-是遗传缺陷引起线粒体异常，致使ATP合成障碍、能量来源不足等导致的一组异质性病变，又称为线粒体细胞病。发病率-约为1:5000（约每5000人中1人发病）Smeitink2006线粒体病mitochondrialdisorders——是一组高度临床变异性和遗传异质性的疾病线粒体蛋白16,569bpcirculardoublestranded(mtDNA)20%1,500nucleargenes80%•structuralproteinoftheOXPHOScomplexes•proteinrequiredforassemblyofOXPHOScomplexes•proteinsinvolvedinmtDNAtranslation•proteinsinvolvedinmtDNAmaintenance•proteinsinvolvedinmitochondrialfusionandfissionDouglasC.Wallace,1817–1819——Shoubridge,2001;Schapira，2000进一步导致线粒体功能异常：①底物的运输缺陷；②底物的利用缺陷；③柠檬酸循环异常；④氧化磷酸化脱偶联；⑤呼吸链异常。发病特点核基因突变——常染色体隐性、显性遗传或X-连锁遗传线粒体基因突变——母系遗传（突变的mtDNA在母血增加，受累及的后代发病频率增加）mtDNA突变与临床表型之间关系复杂，主要表现为同一种mtDNA突变可以引发多种不同的疾病表型，而同一种疾病表型又可以由多种不同的mtDNA突变诱导。遗传异质性婴幼儿起病较常见•编码线粒体结构蛋白的核基因突变进行性外眼肌麻痹（PEO）、线粒体神经肠胃脑肌病、Leigh氏综合征•线粒体蛋白质翻译相关的核基因突变2004年Miller等首次报道核基因编码的线粒体核糖体蛋白亚单位16(MRPS16)纯合突变，导致先天畸形伴张力衰竭、四肢水肿、肝转氨酶活性升高并乳酸亚基中毒症，该女婴在出生后3天死亡。核基因突变线粒体基因突变•突变的影响：引起呼吸链功能缺陷氧化磷酸化酶异常•阈值效应：组织特异性突变的mtDNA在复制分离时可能不均等分配•母系遗传：不同突变后代发病风险不同。相比A8344G突变，携带A3243G突变的母系后代更容易发病。•突变分布：同质性——各器官组织分布相同异质性——不同组织、细胞分布不同一般特点母系遗传（MaternalInheritance）11同质性突变与异质性突变12线粒体基因同质性（Homoplasmy）0或100%异质性（Heteroplasmy）0-100%核基因纯合子（Homozygous）0或100%杂合子（Heterozygous）50%mtDNA同质性/异质性突变与阈值13线粒体基因突变点突变•目前已报道的mtDNA点突变将近330种，涉及mtDNA编码的各个基因，其中结构基因突变177种、tRNA基因突变137种、rRNA基因突变12种、D-Loop区突变2种•LHON、线粒体脑肌病合并乳酸血征及卒中发作综合征、肌阵挛癫痫、破碎红纤维病、母系遗传糖尿病伴耳聋综合征等重排•重排突变逾数百•遗传性痉挛性截瘫等(http：//)线粒体疾病是复杂性疾病遗传方式复杂常染色体隐性遗传（AutosomalRecessive）常染色体显性遗传（AutosomalDominant）性连锁遗传（Sexlinked）母系遗传（Maternallyinherited）临床表型复杂累及多系统（Multisystemicinvolvement）影响几乎所有组织器官（Anyorganortissuecanbeaffected）15线粒体功能涉及众多的组织器官16线粒体病的共同临床特点婴儿期发病：常见于婴儿伴随COX阴性肌纤维、脑病和Leigh综合征。儿童发病：见于MELAS、MERRF、Leigh病、线粒体肌病、线粒体心肌病和KSS。中枢神经系统损害：共济失调、癫痫、肌张力下降、脊髓病等周围神经损害：交感神经病出现在MNGIE和Wolfram综合征视听神经损害：视神经病出现在Leber病和显性遗传视神经萎缩1型听力丧失出现在KSS肌肉病见于线粒体肌病、MELAS和KSS。眼外肌麻痹见于KSS和PEO（高度临床变异性）Chinneryetal.Lancet2000线粒体疾病的生化诊断当患者基因变异不能被确定时，完整的生化检查可以辅助诊断。代谢产物分析（血液、尿液、脑脊液等）血液可以正常，但脑脊液多异常，（动脉比静脉好）；乳酸/丙酮酸比高(50:1)提示呼吸链受到阻断。正常不除外线粒体疾病。酶测定•氧化磷酸化（OXPHOS）系统的酶活性测定。（western、比色法等）方法不稳定•一般情况下，血清CK（肌酸激酶）正常或轻度升高；升高占30%见于慢性进行性眼外肌麻痹；mtDNA丢失时非常高。JinheritMetabDis.2011April;34(2):283-29219线粒体疾病的生化诊断当患者基因变异不能被确定时，完整的生化检查可以辅助诊断。肌肉活检线粒体病的肌肉病理改变特点：（1）出现线粒体结构异常、细胞色素阴性肌纤维或破碎红纤维（RRF）为主要病理改变。（2）上述病理改变出现的频率高。（3）缺乏其他的肌肉病理改变。JinheritMetabDis.2011April;34(2):283-292儿童及成人线粒体疾病的诊断标准A符合线粒体脑肌病各综合征的临床表现如KSS、CPEO、MELAS、MERRF等；•多系统不明原因发病•必须至少三个系统出现临床症状•除先证者外，至少有一个母系家族成员有发病可能•排除其它代谢和非代谢疾病B肌活检在骨骼肌中存在2%破碎样红肌纤维主要诊断标准(Bernieretal,2002)(3,5)21C有以下一种或多种呼吸链酶活性受抑制的表现：•50岁以下肌活检COX阴性肌纤维2%；•50岁以上肌活检COX阴性肌纤维5%；•任一组织中呼吸链酶活性20%；•任一细胞系中呼吸链酶活性30%；•多于两组织内相同呼吸链酶活性30%；主要诊断标准次要诊断标准：A症状符合线粒体脑肌病的临床表现；至少以下一种提示肌肉中线粒体异常的表现：①30~50岁肌活检RRF在1%~2%；②30岁以下肌活检出现RRF；③电镜下见广泛线粒体异常；B至少一种呼吸链功能受抑制的表现：①生化或极谱描记的呼吸链复合物活性在20%~30%；②用免疫方法证实呼吸链复合物表达减少；(Bernieretal,2002)(3,5)次要诊断标准：C发现可能相关的mtDNA异常；D一种或多种氧化磷酸化受损的表现：①脑脊液或血中乳酸、丙酮酸和(或)丙氨酸增高；②若疑为KSS，脑脊液蛋白质增高；③PET或31P-MRS证实肌肉或脑代谢降低；④最大氧分压、平均氧分压或乳酸阈值降低。(Bernieretal,2002)(3,5)符合以上2个主要诊断指标或1个主要诊断指标及2个次要诊断指标的即为确诊线粒体病；符合1个主要诊断指标及1个次要诊断指标或至少3个次要诊断指标的为拟诊线粒体病；符合1个主要诊断指标或在符合临床表现的基础上还具备1个次要诊断指标的为疑诊线粒体病。JinheritMetabDis.2011April;34(2):283-292线粒体病诊断时应注意基因诊断与生化检查如能量代谢情况、呼吸链和酶复合体活性等相结合要区分病理性突变和正常衰老所致的线粒体基因突变线粒体基因异常与临床表现的严重程度之间存在量效关系散发与遗传的相关性，诊断是否遗传需排除环境、药物和衰老等因素第一节线粒体基因组与疾病线粒体基因组及其表达系统线粒体基因组与细胞核基因组的相互关系线粒体基因组变异与疾病2627人类线粒体基因组Lightstrand:8tRNAand1mRNA(ND6)Heavystrand:14tRNA,2rRNA,and12mRNAPolycistronicwithposttranscriptionalprocessing•基因组小,仅16569bp•双链环状DNA•13结构基因/mRNA•22tRNA基因•2rRNA基因•12SrRNA基因•16SrRNA基因•非编码区•D-loop（约1120bp）•L链复制起始区（约30～50bp，tRNAAsn-tRNACys）•高突变率线粒体基因组及其表达系统2ATPase6ATPase83CytochromeoxidaseI,II,III1Cytochromeb07ND1-6,ND4LMitochondrialDNASubunits~141010439NuclearDNASubunitsOligomycinCyanideCarbonMonoxideAzideAntimycinATTFAmalonateRotenoneAmytalInhibitorATPSynthaseCytochromeCOxidaseCoQ-CytochromeCReductaseSuccinate-CoQReductaseNADH-CoQReductaseEnzymeVIVIIIIIIComplex2ATPase6ATPase83CytochromeoxidaseI,II,III1Cytochromeb07ND1-6,ND4LMitochondrialDNASubunits~141010439NuclearDNASubunitsOligomycinCyanideCarbonMonoxideAzideAntimycinATTFAmalonateRotenoneAmytalInhibitorATPSynthaseCytochromeCOxidaseCoQ-CytochromeCReductaseSuccinate-CoQReductaseNADH-CoQReductaseEnzymeVIVIIIIIIComplexThetwostrandsofmtDNAaredifferentiatedbytheirnucleotidecontentwiththeguaninerichstrandreferredtoastheheavystrand,andthecytosinerichstrandreferredtoasthelightstrand.Theheavystrandencodes28genes,andthelightstrandencodes9genesforatotalof37genes.Ofthe37genes,13areforproteins(polypeptides),22arefortransferRNA(tRNA)andtwoareforthesmallandlargesubunitsofribosomalRNA(rRNA).CategoryGenesNADHdehydrogenase(complexI)MT-ND1,MT-ND2,MT-ND3,MT-ND4,MT-ND4L,MT-ND