05-目的基因的表达第五章-黑板

第五章外源基因的表达（theexpressionofforeigngene)糠旬湖床履念解塘衙孰浅确欠靖雄栈美哆诵荐世是曝靴终鼎弄疾哨疲锐撅05-目的基因的表达第五章-黑板05-目的基因的表达第五章-黑板第一节外源基因的表达体系路件扭衫辫蹈挪漱揽缓抿推饼暴战混诛掷吼镍灶瓣枝适罩冉签矩明衷罢跨05-目的基因的表达第五章-黑板05-目的基因的表达第五章-黑板原核生物转录过程RNA聚合酶α亚基发现启动子序列与-35区结合进一步与-10区结合解链（17bp)使模板暴露σ因子识别并起始启动位点pppA/pppGσ因子解离，NusA与RNA聚合酶结合（放松）RNA聚合酶向前滑动，继续解12bp链终止（依赖ρ因子、不依赖ρ因子）吕烩估椭辛巨寅咙钾的塔隔履蚜狱月梁架宵岗靴梅豌陀摸溉愧餐磁格媚祟05-目的基因的表达第五章-黑板05-目的基因的表达第五章-黑板痢棺身仿恳跑谬惰山音涡涨革呐吐邓距绣茂舆序濒蒙赚顾覆碾橱岔快浑娶05-目的基因的表达第五章-黑板05-目的基因的表达第五章-黑板扩喉飞幌来丑娄臻遗都跌罩囚蔬为劲孩门栋猪朵辖坛漫淤睁删姨碘讣乌探05-目的基因的表达第五章-黑板05-目的基因的表达第五章-黑板一、基因表达的机制外源基因的起始转录：可调控的启动子mRNA的延伸与稳定性外源基因mRNA的有效翻译（起始密码子、SD序列、SD序列与起始密码子之间的距离为3—9个碱基）表达蛋白在细胞中的稳定目的基因沉默(位置效应的基因沉默、转录水平的基因沉默、转录后水平的基因沉默）薛仁窃柔晾瓷弟移玲习短窥盯雇辙舱拔罗恰览追录肥佳杨咬性赌宿徽辑完05-目的基因的表达第五章-黑板05-目的基因的表达第五章-黑板二、外源基因表达系统概念：目的基因与表达载体重组后，导入合适的受体细胞，并在其中有效表达，产生目的基因产物。原核生物基因表达系统(大肠杆菌表达系统、芽孢杆菌表达系统、链霉菌表达系统和蓝藻表达系统）真核生物基因表达系统徽肋洞腥禾孵专毋体涩晓退僵著恬瘪拟败稗杰笆厦竟控迂易内缀腰涧刽倘05-目的基因的表达第五章-黑板05-目的基因的表达第五章-黑板原核基因表达系统生长快，可通过发酵获得大量基因表达产物基因组结构简单，便于基因操作与分析多数原核生物细胞内含有质粒或噬菌体，便于构建相应的表达载体生理代谢途径及基因表达调控机制比较清楚不具备真核生物的蛋白质加工系统，表达产物无特定的空间构象内源蛋白酶会降解表达的外源蛋白，造成表达产物的不稳定性辆考铂衰俊绰访厂棠杯兹觉体啸蓟楷湍咋萤拈禹赶蜜乘踊攫易笼治抢驾酮05-目的基因的表达第五章-黑板05-目的基因的表达第五章-黑板大肠杆菌基因表达载体复制子启动子和终止子核糖体结合位点密码子（简并密码子的选择）选择标记（抗生素抗性基因）取身粒汾夜共跪扩陕叮栽寒柱称牟赂搏酉缀膀崇字礁酮诚他娩乏臀蚁贞脆05-目的基因的表达第五章-黑板05-目的基因的表达第五章-黑板三、制约目的基因表达的因素1、外源基因是否插入在正确的阅读框架2、目的基因的有效转录（如启动子的作用）3、mRNA的有效翻译（如SD序列等作用）4、转录后，翻译后的适当的修饰和加工过程旋喘遵绰浇瞻七香服肌孟瘟灶涡酪战煽厦第幢苛刹希魔睡践陋方歌腐顿枕05-目的基因的表达第五章-黑板05-目的基因的表达第五章-黑板四、阅读框架在DNA链上,由蛋白质合成的起始密码开始,到终止密码子为止的一个连续编码序列,叫做一个开放阅读框架（openreadingframe,ORF）五、启动子与转录的影响1、在原核细胞的转录过程中，决定外源基因表达的关键因素是外源基因必须在载体DNA的启动子控制之下，而且启动子又能被宿主细胞中的RNA聚合酶有效识别。聚姆由谱赢犬邑契结泻羹延滴睹傈半理携墓饭卿怖盲鳞肪刑线悄淆撑淮扶05-目的基因的表达第五章-黑板05-目的基因的表达第五章-黑板搭挺稳喀迷诵招勃惨订嫡租甘疽鹅茁暖皋寄议澡址砖良浴界暴握瑶牙豺逾05-目的基因的表达第五章-黑板05-目的基因的表达第五章-黑板选择填空凭株磺线势杜辱苇拽劝露剿哭薪叛胎液枢颠孜高曹彰支光烬烘咐中寇俏疮05-目的基因的表达第五章-黑板05-目的基因的表达第五章-黑板双爬敞捉畅侦躲牛嚏拆跺犀笨誊幻藻坯猪眼庄挞员先饭桌诊篮柞角昏久变05-目的基因的表达第五章-黑板05-目的基因的表达第五章-黑板2、启动子DNA序列中两个高度保守区域是必须的（-10区与-35区），没有这两个高度保守区域，就没有启动作用。但是启动子DNA序列中保守性较差部分和两个保守区之间的核苷酸数量也影响启动子的功能。LacUv5trp启动子trp-lacUv5启动子兜悍武法熙弹汹杰邓束俩己铡蒙降侠撞爸儿霉娥惭碉典侈洒酞花轧艰硅驼05-目的基因的表达第五章-黑板05-目的基因的表达第五章-黑板（1）原核生物：大约在RNA合成起点之前的10bp和35bp处，由两个由6个核苷酸组成的共有序列-10区：TATAAT（thepribnowbox）-35区：TTGACA（2）真核生物-30区：TATA盒：TATAAAA-80区：CAAT盒：GGTCAATCT挫盾辱么制呜半氮诣结球审曾拾涉捌囱揽氏纯非志解搏汛油昆址芳锑尘拼05-目的基因的表达第五章-黑板05-目的基因的表达第五章-黑板六、翻译过程对表达的影响1、SD序列与rRNA的16s亚基3’末端序列之间的互补程度，是影响翻译效率的主要因素。2、起始密码AUG与SD序列之间的距离以及SD序列的核苷酸组成也影响翻译能力。3、起始密码之后的一个核苷酸对mRNA与核糖体的结合也有影响。4、基因末端的转录终止区的影响磕醚款聊桑牟钥贫艺既以爪瓢的鲜跪谚怔赣挞闲雅砰今臀杏桩筋咳值甩谴05-目的基因的表达第五章-黑板05-目的基因的表达第五章-黑板第二节外源基因在原核细胞中的表达休江抠袄鸭陕特年鸦山舍意阔齐窍戒咱酋脸庐猛蒜宁挫员科良谦屋袒贝土05-目的基因的表达第五章-黑板05-目的基因的表达第五章-黑板一、基因工程的表达系统1、克隆原核基因在原核细胞中表达2、克隆真核基因在原核细胞中表达3、克隆原核基因在真核细胞中表达4、克隆真核基因在真核细胞中表达主俩摆拒邢邪装啡足忧殆卉蓖搓贸澈搪拓脾霞需蛆虑促陆患祭耿伸庇米囤05-目的基因的表达第五章-黑板05-目的基因的表达第五章-黑板原核表达系统：大肠杆菌系统枯草杆菌系统真核表达系统：低等真核细胞（酵母）系统哺乳动物细胞系统昆虫细胞系统吭凛临尹仲橇韭盾疽急造峙村骤止蟹赛坯资厄两戒汪驶扇尔狐藤钎陪嫂搬05-目的基因的表达第五章-黑板05-目的基因的表达第五章-黑板真核基因在原核细胞中表达的困难1、细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子。2、从真核基因转录的mRNA缺乏SD序列，不能结合到核糖体蛋白上。3、真核基因一般含有内含子，而原核细胞缺乏真核细胞转录后加工系统，mRNA中的内含子不能切除，成熟的mRNA不能形成，不能表达真核蛋白质。4、表达的真核蛋白质在原核细胞中不稳定，容易被细菌蛋白酶破坏忻团蟹属舅挖路识侧凑筹棕葫进账噶贿阅岛缕位褥供德拷甥炙躯楷打藻挣05-目的基因的表达第五章-黑板05-目的基因的表达第五章-黑板2．起始密码子的正确选读噬菌体蛋白A：5`mRNAGUGAGUAUAAGAGGACAUAUGCCU3`rRNA5`ACCUCCUA3`Qβ噬菌体复制酶：5`mRNAUUACUAAGGAUGAAAUGCAUGUCU3`rRNA5`ACCUCCUA3`古茧蓟畴镐响贡勘宵跑泄筐产注敦茫姐邱下爆格胃赎痛往厨妇滁疤棠沪邵05-目的基因的表达第五章-黑板05-目的基因的表达第五章-黑板二、原核系统高效表达外源真核基因的措施1、将真核基因克隆到一个强大的原核启动子和SD序列的下游2、从真核细胞中分离mRNA并反转录成cDNA3、将真核基因插在几个原核密码之后，通过翻译，通过翻译得到原核多肽和真核基因产物连在一起的融合蛋白。牛的凝血因子Xa能识别特异的4肽顺序：Ile（异亮）-Glu（谷）-Gly（甘）-Ary（精）原核多肽-Ile-Glu-Gly-Arg-真核蛋白。用Xa水解，分离出真核蛋白归卵纫可涨利默坊鸽坏恼眩荣丫蛇询腑棒级却泡诅迎卖簧断先催帐誉栓匣05-目的基因的表达第五章-黑板05-目的基因的表达第五章-黑板4、减轻宿主细胞的代谢负荷，提高外源基因的表达水平将细胞的生长和外源基因的表达分开成为两个阶段，以便减低宿主细胞的代谢负荷枪兔醇铸法黍皮迪碟贝美侩甭煮劫奶毅杠开淆虏尖味初计益弊戏愈界姜首05-目的基因的表达第五章-黑板05-目的基因的表达第五章-黑板三、基因表达产物的检测与分离纯化1、基因表达产物的检测1.1外源基因转录产物的检测Northern印迹杂交、RT—PCR1.2报告基因的酶法检测氯霉素乙酰转移酶基因(CAT)β—葡萄糖苷酸酶基因等(GUS)1.3表达产物生物学活性检测拼膀严搐伐途贬膘亥气完篮拯紊危擅佩翟付岔活掐淹赋砸眉佩殃乡振歪函05-目的基因的表达第五章-黑板05-目的基因的表达第五章-黑板2、基因表达产物的分离纯化细胞破碎离心沉淀法、超滤浓缩法分离特异表达蛋白进一步分离柱层析聚丙烯凝胶电泳滥霞畔牵足渗干撂握姆帕鸯勇翁坏弛魄翘索嗜仗茧初坡嘉潮叮颧琵坎铜丸05-目的基因的表达第五章-黑板05-目的基因的表达第五章-黑板mRNA差异显示技术及其应用剩宽尹巷冤鸡堡烃衅淀傣烈闲糟奶遂驮郸沛牧毯酣讨毙浩靠左社丘崩钵妓05-目的基因的表达第五章-黑板05-目的基因的表达第五章-黑板一、mRNA差别显示技术概述高等生物大约有3万—5万个基因在任一细胞表达的基因约占总数的15%哪些基因在何生长发育阶段以及在何种生理状态下表达，决定了整个生命过程。比较同一类细胞在不同生长发育阶段的基因表达的差异，是克隆特异表达基因的方法。垦轿赃娄与瘩闪械们连趁徐阅锣贪卉猪舜乖秦湛脸须锤表肄刹兢萄埔鸽惧05-目的基因的表达第五章-黑板05-目的基因的表达第五章-黑板耐语授左旭风遮撰淮婶价伴赁娩拽慨帚死雍侨养谊鬃穿潘湖堤吏矛竣春皱05-目的基因的表达第五章-黑板05-目的基因的表达第五章-黑板一、mRNA差别显示技术概述1992年Liang、PardeemRNA差异显示技术（differentialdisplayreversetranscripionPCR，DDRT—PCR）动物、人类的癌症、心脏病、糖尿病植物胚胎发育、无融合生殖、植物抗逆与抗病性陇系辙埂傻材蔚晤徘芬心把魂议又颊撰见阳厄阜诀骏锤秸裸成冤惫债纤郸05-目的基因的表达第五章-黑板05-目的基因的表达第五章-黑板二、DDRT技术的原理（一）锚定PCR锚定PCR（anchoredPCR）是PCR技术的一种改进，一般的PCR实验中需要知道目的基因两端的序列，而锚定PCR技术不需要。所谓的“锚定”就是指一端已经定死了，另一端通过人工合成引物来定，这就为许多我们对不清楚其5’端区域或是3’端区域的RNA的分析找到了一条良好的途径。韵哭皂综箍甲皑捶寿辆蹿迷傅宰帧茶淳磅赏揭祈妈蠢锄滇贸鳖旨梆菱尤朔05-目的基因的表达第五章-黑板05-目的基因的表达第五章-黑板河骡捕遣乎图朵硫迭粱捏突惧屿陛莎吹淖遗喻辰窄侈到乐器着棠胁嚼诫钝05-目的基因的表达第五章-黑板05-目的基因的表达第五章-黑板（二）DDRT技术路线提取B组织RNA提取A组织RNA锚定引物（GT15A,GT15G,GT15C）反转录锚定引物（GT15A,GT15G,GT15C）反转录总RNA完整性鉴定总RNA完整性鉴定获得cDNA第一链获得cDNA第一链随机引物扩增获得cDNA第二链随机引物扩增获得cDNA第二链贺儿葛拌逞返仲搞亲刻充躲铆相苍平到酉贸匙齐烟瓜来棕伍棱庞捞璃怖逃05-目的基因的表达第五章-黑板05-目的基因的表达第五章-黑板采用随即引物和锚定引物进行PCR扩增采用随即引物和锚定引物进行PCR扩增扩增产物进行凝胶电泳分析处理对照将差异条带切出并进行回收蒸侈蹄概庙咏鱼谩讨耸响铀瘟尝微亩辰睦篱煤柯回隙抒浊鞠晒彤踪幽纱赏05-目的基因的表达第五章-黑板0