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课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数专题2微生物的培养与应用一、课题背景1、尿素的利用尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。2、细菌能利用尿素的原因土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶CO(NH2)2脲酶+H2O+CO22NH33、常见的分解尿素的微生物芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。4、课题目的①从土壤中分离出能够分解尿素的细菌②统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌一.研究思路㈠.筛选菌株㈡.统计菌落数目㈢.设置对照（一）筛选菌株提出的问题—如何寻找耐高温的酶？解决问题的思路—寻找耐高温环境；原理—高温淘汰其他菌，选出耐高温细菌，耐高温菌种提取耐高温酶。1、实例：PCR技术启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。（筛选思路）原因：因为热泉温度70～800C，淘汰了绝大多数微生物只有Taq细菌被筛选出来。DNA多聚酶链式反应是一种在体外将少量DNA大量复制的技术，此项技术要求使用耐高温（720C）的DNA聚合酶。(一).筛选菌株：从哪里去寻找这种耐高温的酶呢？为什么？要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等；方法：⑴抑制大多数微生物的生长⑵促进目的菌株的生长结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过平板稀释等方法对它进行纯化培养分离。2、实验室中微生物的筛选原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。15.0g琼脂1.0g尿素10.0g葡萄糖0.2gMgSO4`7H2O2.1gNaH2PO41.4gKH2PO43、本课题使用的培养基配方：①从物理性质看此培养基属于哪类？固体培养基②在此培养基中哪些作为碳源、氮源？碳源：葡萄糖、尿素氮源：尿素③.分析该配方的培养基对微生物是否具有筛选作用？如果有，又是如何进行筛选的？有筛选作用。尿素是培养基中的唯一氮源，因此，原则上只有能够利用尿素的微生物才能够生长。答：不一定，有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物生长繁殖，因此能够在选择培养基上生长的微生物不一定是所需要的微生物，还需要进一步的验证。④.只要能够在选择培养基上生长的微生物是否就是所需要的微生物？培养基的唯一氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。4、该培养基选择分解尿素的微生物的原理选择培养基：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。5、怎样证明此培养基具有选择性呢？以尿素为唯一氮源的培养基牛肉膏蛋白胨培养基是分离能分解尿素的细菌判断该培养基有无选择性实验组对照组培养基类型是否接种目的结果生长能分解尿素的细菌生长多种微生物是对位训练分离土壤中分解尿素的细菌，对培养基的要求是（）①加尿素②不加尿素③加琼脂④不加琼脂⑤加葡萄糖⑥不加葡萄糖⑦加硝酸盐⑧不加硝酸盐A.①③⑤⑦B.②④⑥⑧C.①③⑤⑧D.①④⑥⑦C1、显微镜直接计数：利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。㈡.统计菌落数目：不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；缺点2.间接计数法（活菌计数法）（1）常用方法：每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。（2）原理：稀释涂布平板法。例：两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。2、乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？甲：没有重复实验（至少涂布3个平板）乙：A组结果误差过大，不应用于计算平均值注意事项①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30——300的平板上进行计数。②为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出菌落平均数。（设置重复实验）③统计的菌落往往比活菌的实际数目低。（原因：a、由于两个或多个细菌连在一起时，稀释涂布培养后只能观察到一个菌落；b、统计结果只是活菌产生的菌落数，而未包括死细菌数目）设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。㈢.设置对照：实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，A同学从对应的106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落。分析其原因。原因：⑴土样不同，⑵培养基污染或操作失误(或者是混入了其他的含氮物质)小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。结果预测：如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。实验组：对照组：2.判断选择培养基是否具有选择作用1.判断培养基是否被杂菌污染实验组：对照组：接种的培养基未接种的培养基（空白对照）在相同条件下培养，观察未接种的培养基上是否有菌落。选择培养基牛肉膏蛋白胨培养基接种后培养，观察两种培养基上菌落数目，进行对比得出结论。二实验设计二实验设计1.实验设计的内容包括：二实验设计1.实验设计的内容包括：实验方案、材料用具、实施步骤和时间安排等。在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。制备培养基：准备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基。二实验设计1.实验设计的内容包括：2.实验流程：实验方案、材料用具、实施步骤和时间安排等。二实验设计1.实验设计的内容包括：2.实验流程：实验方案、材料用具、实施步骤和时间安排等。（1）土壤取样二实验设计1.实验设计的内容包括：2.实验流程：（1）土壤取样从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。实验方案、材料用具、实施步骤和时间安排等。土壤细菌绝大多数分布在距地表约3~8cm的土壤层二实验设计（2）样品的稀释二实验设计（2）样品的稀释样品的稀释程度将直接影响平板上生长的菌落数目。（1）测细菌数：一般用104、105、106稀释液（2）测放线菌：一般用103、104、105稀释液（3）测真菌数：一般用102、103、104稀释液原则：确保平板上的菌落数在30∼300之间。将待测样品经过一系列的稀释，然后选择三个稀释度的菌液均匀涂布在平板上，然后培养。将10g土样加入盛有90mL无菌生理盐水的锥形瓶中，充分摇匀，吸取上清液1mL，转移至盛有9mL的生理盐水的无菌大试管中，依次等比稀释至107稀释度，并按照由107～103稀释度的顺序分别吸取0.1mL进行平板涂布操作。按照浓度从低到高的顺序涂布平板，不必更换移液管。由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为103～107。为了结果接近真实值，可将同一稀释度菌液涂布到3个或3个以上的平板上，经培养，计算出菌落的平均数。为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？答：这是因为土壤中各类微生物的数量是不同的，例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。因此，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。（3）取样涂布◆实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。◆如果得到了2个或2个以上菌落数目在30——300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。（4）微生物的培养与观察在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。培养不同微生物往往需要不同培养温度。细菌：30～37℃培养1～2d放线菌：25～28℃培养5～7d霉菌：25～28℃的温度下培养3～4d。将涂布好的培养皿放在30℃温度下培养。随着培养时间的延长，会有不同的菌落产生。比较牛肉膏培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录。（4）微生物的培养与观察微生物的培养与观察（5）鉴定：筛选后必鉴定鉴别培养基：不影响微生物的生存挑选选择培养基中不同形态的菌落接入含酚红培养基的斜面中，观察能否产生如课本中图2-10的颜色反应。如果有则说明该选择培养基中确实含有能分解尿素的细菌。酚红培养基：鉴定分解尿素的细菌。原理：脲酶催化尿素分解成氨→培养基碱性增强→酚红变红→脲酶阳性酚红在低pH值时呈现黄色,在高pH值时呈现红色三、操作提示无菌操作做好标记制定计划（一）培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出菌落对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。牛肉膏培养基的菌落数目明显大于选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。（二）获得某一稀释度下，菌落数30～300的平板，在这以稀释度下是否至少有两个平板的菌落数相接近？如果得到了2个或2个以上菌落数目在30～300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数。四.结果分析与评价（三）如果学生选取的是同一种土样，统计的结果应该接近。如果结果相差太远，教师需要引导学生一起分析产生差异的原因。在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。五.课题延伸菌种的进一步鉴定（1）原因：由于分离分解尿素的细菌的选择培养基上可能生长着以分解尿素的细菌的代射产物为氮源的其它微生物。（2）原理：CO(NH2)2+H2OCO2+2NH3；由于NH3的产生，培养基碱性增强，pH升高，因此可通过检测pH的变化来判断该化学反应是否发生。（3）方法：以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌，若指示剂变红，则pH升高，说明该种细菌能分解尿素。脲酶测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到伊红美蓝培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现黑色，通过记述得出水样中大肠杆菌的数量。大肠杆菌呈黑色，中心有或无金属光泽大肠杆菌在伊红美蓝琼脂(EMB)上典型特征本课题知识小结:巩固练习1.使用选择培养基的目的是（）A.培养细菌B.培养真菌C.使需要的微生物大量繁殖D.表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别2.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是()A.CO2和N2B.葡萄糖和NH3C.CO2和尿素D.葡萄糖和尿素CD3.下列说法不正确的是（）A.科学家从70－80度热泉中分离到耐高温的TaqDNA聚合酶。B.统计某一稀释度的5个平板的菌落数依次为M1、M2、M3、M4、M5，以M3作为该样品菌落数的估计值。C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度D.同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。4.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入（）A.较多的氮源物质B.较多的碳源物质C.青霉素类药物D.高浓度食盐BC