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人類胎盤促乳激素與人類促乳激素穿插嵌合重組蛋白對人類促乳激素接受體結合能力與抗乳癌相關機制之研究藍珮菁Pei-ChingLan張正教授Advisor:C.AllenChangNationalChiaoTungUniversityBiologicalScienceandTechnology研究背景胎盤及胎盤素•中國的漢方醫學寶典本草綱目中，對於乾燥胎盤-紫河車有記載•胎盤是母體傳遞胚胎生長發育所需物質的通道–前四週發育快速…•胎盤素之功效，廣為生醫界所研究，其具有幫助細胞新生、及增強免疫機能等功效–風濕性關節炎研究背景胎盤及胎盤素研究背景胎盤促乳激素（PlacentaLactogen）與促乳激素(Prolactin)•胎盤促乳激素（PlacentaLactogen,PL）–22.3kDa蛋白質–只由胎盤生產–初期了解可促進母體乳腺之生長與乳汁之生產。•促乳激素(Prolactin,PRL)–腦下垂體前葉所分泌–22.5kDa蛋白質–在生產後調控乳汁中之酪蛋白(casein)與乳蛋白素(lactabumin)之製造以及乳汁分泌。研究背景促乳激素與訊息傳遞JAK-STATpathwayRas-MAPKpathway研究背景促乳激素與訊息傳遞oPL/PRLRx-raystructure研究背景胎盤促乳激素（PlacentaLactogen）與促乳激素(Prolactin)•訊息傳遞:JAK2kinase-STAT路徑、ras-MAPK路徑•最近一些研究報告指出，促乳激素會影響thymicstromalcell的IL-1與IL-6的表現量，進而影響T細胞的分化。IL-6在體外試驗上也表現出抑制鼠的胎盤促乳激素的分泌量。顯示促乳激素與細胞動素亦有關連，但其機制尚不清楚。•最近的研究顯示促乳激素與乳癌有其相關性研究背景乳癌與乳癌用藥•乳癌在國人及世界婦女癌症中，一直佔有很高的比例。•乳癌：乳房乳腺管細胞或是腺泡細胞經由不正常分裂、繁殖所形成之惡性腫瘤。•乳癌的治療：開刀、放射線治療、化學治療與荷爾蒙療法研究背景乳癌與乳癌用藥•化學治療藥物：fluorouracil（5-FU）與anthracycline(ex.doxorubicin)為第一線藥物•荷爾蒙療法：以對抗動情激素接受體(estrogenreceptor)的藥物為主，如tamoxifen。•衛生署藥政處通過用於治療乳癌的新藥：–化學療法：太平洋紫杉醇（Taxol）、歐洲紫杉醇（Taxotere）、滅癌平（Navelbin）與截瘤達（Xeloda）–荷爾蒙療法：安美達（Arimidex）。研究背景乳癌與乳癌用藥•目前對乳癌的荷爾蒙療法主要是以對抗動情激素接受體(estrogenreceptor，ER)的藥物為主--無法完全抑制乳癌細胞的成長。–Tamoxifen亦會抑制由促乳激素引發的ER-negativeNb2ratlymphomacells的生長。--ER以外的receptor•在一些報告中指出促乳激素(PRL)可能為對抗乳癌的另一個目標。–會過量表現促乳激素的基因轉殖鼠在11至15月齡即出現乳癌腫瘤—PRL有影響–經由蛋白質水解酵素水解的促乳激素片段，可表現出有抑制血管新生的作用—PRL有影響研究背景乳癌與乳癌用藥—接受體•PRL對抗乳癌的接受體研究：•Dopaminereceptor–但由最近的研究報告指出其與乳癌的相關性小，所以抑制Dopaminereceptor對治療乳癌可能是無效的。•PRLreceptor：–PRL專一結合，抗乳癌接受體目標•PL、GH也會與PRLreceptorbinding–PLPRLGH研究背景擬解決問題•針對PRLreceptor研究抗乳癌藥物•利用PL與PRL特性研發不產生生理功用的蛋白質–蛋白質片段：成分複雜不易控制–嵌合重組：可掌握蛋白質性質研究背景基因隨機的嵌合重組•相關的基因做隨機的嵌合重組，可以得到多樣化的新型基因，而成為一組新蛋白質的基因庫。•Geneshuffling為一快速產生chimericallibrary的方法。–利用DNaseI將相似的gene做隨機的剪切成小片段，再以此小片段基因的互補做PCR，可隨機的將基因相連而成互相鑲嵌的新的基因。由於鑲嵌的順序隨機且互不相同，分析新的基因庫，可以獲得更多的蛋白質資訊，並且可以由特定目標的篩選而得到功能更佳的基因及蛋白質。研究背景基因隨機的嵌合重組研究背景基因隨機的嵌合重組•將hPL、hPRL做隨機的geneshuffling，藉由鑲嵌而成的基因序列，可分析這一family的蛋白質的結合作用、codingpotential、tissuespecificity跟genefunction，藉由DNAsequence以及computermodeling，可比較不同蛋白質之結構與性質的關係。•而藉由此蛋白質與PRL接受體的競爭力分析，及進一步的細胞動素分析，可作為抗乳癌藥物之candidate或是乳腺發育不全的治療。PLgenecloningPRLgenecloningPRLRgenecloningInvitroassayBindingconstantYeasttwohybridDNAshufflingPLPRLMutantgene工作項目及實施方法1.人類促乳激素接受體(hPRLreceptor)基因分子選殖•為了進行重組促乳激素的篩選，本實驗室必須有促乳激素接受體基因以表現其蛋白質。PCRcloningvectorE.coli做藍白篩選限制酵素來剪切DNA定序確認選殖入表現穿梭載體如：pQE30E.colicheck表現選殖出之促乳激素接受體工作項目及實施方法2.人類促乳激素(hPRL)之基因分子選殖與蛋白質表現•為了進行重組促乳激素的篩選，以及測試將來進行shuffling重組時的PCR條件，本實驗室亦進行促乳激素基因選殖，並可將其表現之蛋白質與市售隻促乳激素蛋白質加以比較。PCRcloningvectorE.coli做藍白篩選限制酵素來剪切DNA定序確認選殖入表現穿梭載體如：pQE30E.colicheck表現選殖出之促乳激素工作項目及實施方法3.hPL與hPRLgeneshuffling0.005UDNaseI剪切hPL與hPRLgeneRT10-30min95℃10minice10min1.4﹪agarose電泳200-500bpprimelessPCRPrimerPCRCloningvectorE.colishufflinglibraryDNAsequence工作項目及實施方法4.Shufflinggene與hPRL結構之分子模擬•利用電腦程式,如Rasmol、insightII•將已選殖出之hPRLreceptorgene進行電腦模擬，加上PRL之模擬結果，以得到兩蛋白質互相作用之模式。•模擬各Shufflinggene之三級結構,比較其蛋白質結構，並由模擬預測可能之功能性,如與receptor之結合位置。工作項目及實施方法5.Shufflinggene與hPRLreceptor之結合力試驗•Yeasttwo-hybridsystem是近年發展的蛋白質交互作用研究方法。–以yeasttwohybrid的方法，以hPRLreceptor為釣餌，找出與hPRLreceptor有交互作用的Shufflinggene–hPRLRgene--pGBKT7vector–shufflinggene--pGADT7vector–yeast表現出轉錄活化之表型•如lacZ基因表現而使加入X-gal培養之菌體產生藍色•Essentialgene–存活工作項目及實施方法Shufflinggene與hPRLreceptor之結合力試驗•其利用將釣餌蛋白的基因剪接入一帶有DNAbindingdomain基因之現載體，以產生釣餌蛋白與DNAbindingdomain之融合蛋白；另外候選之library基因則剪接入一帶有轉錄活化因子基因之載體，以產生候選蛋白與轉錄活化因子之融合蛋白•當此兩種選殖載體均被轉型入酵母菌內，若釣餌蛋白與候選蛋白產生交互作用，則DNAbindingdomain會與酵母菌內之DNA結合，轉錄活化因子則促使標示基因表現，如此則可以挑出可與釣餌蛋白質交互作用之候選蛋白質。工作項目及實施方法6.Bindingconstant•Yeasttwohybrid：定性•藉由ELISA方法測定重組蛋白質與接受體的結合常數。–另一個篩選的方法：可以將shuffling的protein點於晶片上，再利用帶有標示的receptorprotein，來將與hPLR有交互作用之蛋白質篩選出。–參考各文獻的方法，以gelfiltration來分析與hPRLreceptor之競爭力。•對hPRLreceptor有較大競爭力者，可能為抗乳癌藥物candidate。工作項目及實施方法7.NMR/X-Ray蛋白質結構測定•將與清華大學余靖教授合作進行NMR測試•與中研院袁小含博士合作進行X-Ray測定重組蛋白質的分子結構。工作項目及實施方法8.Clinicalstudies•篩選出可能有功用之重組蛋白質後，將再以乳腺細胞株做invitroassay。•以特定乳癌老鼠進行animalmodel試驗。9.hPL之細胞動素(cytokine)變化•乳腺細胞株與hPL或重組蛋白共同培養之，測定cytokine如IGF-1、IL量之變化或其他cytokine量之變化。目前研究結果1.DNAshuffling試驗•先前的試驗，試以不同濃度DNaseI與不同作用時間的搭配，尋找出可以適當剪切DNA為不同大小片段的條件。–最後以以0.005U的DNaseI剪切DNA，室溫作用10分鐘，可得到較佳的剪切情況，最小片段可由電泳膠片上看出約200bp。200bp目前研究結果1.DNAshuffling試驗•而在將DNA片段重新組合的PCR試驗，則先以Taq聚合脢做試驗，但卻無法正確生合成所要的DNA。•後經參考paper上以辨識度較高的聚合脢做效果較好，則改以rTth聚合脢做重組的PCR，則可得到重組的DNA。目前研究結果1.DNAshuffling試驗•Shuffle重組的DNAlibrary，經酵素剪切，接入cloningvector來載入shuffling之基因，再轉型入E.coli中。–經過DNA初步定序，發現有二個重組DNA可能是有變化的。分別命名為pSPRS314-2-2與pSPRS314-3-3b46目前研究結果2.TLC與HPLC分析–突變株TKRMY68及對照之野生株CBY57(無CAS基因)–以SD培養液培養3天後，收集菌液，萃取其不皂化之脂類物質–經TLC分析，可明顯辨識出TKRMY68會產生一新的環化物質。目前研究結果2.TLC與HPLC分析•以HPLC分析，OSD4.6x250mm管柱，CH3CN1ml/min沖提，UV202偵測•突變株TKRMY68的萃取物於大約25分鐘時較野生株CBY57的萃取物多了一個peak。目前研究結果3.PRL基因選殖•PL基因已由林孟嘉同學於本實驗室選殖出。•PRL基因則參考基因庫裡的DNA序列設計引子，欲以PCR放大的方法來選殖。–hPRL(I)-30[BamHI]:5’-CGCGGATCCAACATGAACATAAAGGATCG-3'–hPRL(II)-24[HindIII]:5’-CCCAAGCTTGCAATGGAACGGATC-3’•試驗不同DNA聚合脢，決定以superTherm聚合脢做PCR•選殖入pBluescriptIISK+vector，經轉型入XL1BlueE.Coli，萃出其plasmid，由瓊脂膠體電泳為約4kb相當於insert+vector大小的plasmid。目前研究結果4.PRLR基因選殖•PRLR基因亦參考基因庫裡的DNA序列設計引子，欲以PCR放大的方法來選殖。–hPLR(IIB)-30[EcoRI]:5’-CCGGAATTCCTTCTGATACATTTCCTGCAG-3'–hPLR(II)-30[KpnI]:5’