4非肠道原核细菌基因工程(正)

第4章非肠道原核细菌基因工程芽孢杆菌系统非肠道原核系统棒状杆菌系统：氨基酸高产链霉菌系统梭菌系统：利用纤维素、木质素发酵产乙醇乳酸菌系统：食品基因工程假单孢菌系统：环保基因工程硫杆菌系统：煤生物脱硫其它系统高效分泌表达：枯草/短小芽孢杆菌高效分泌表达外源基因构建抗生素高产株或新型抗生素生物农药：苏云金芽孢杆菌E芽孢杆菌的分泌表达系统C芽孢杆菌的宿主系统B芽孢杆菌的克隆载体系统A芽孢杆菌作为表达外源基因受体菌的特征F重组芽孢杆菌在昆虫毒素蛋白生产中的应用D芽孢杆菌的转化系统芽孢杆菌的基因工程*革兰阳性细菌、好氧、杆状*一旦营养供应受限即形成芽孢A芽孢杆菌作为表达外源基因受体菌的特征芽孢杆菌的生物学特征芽孢杆菌表达外源基因的优、缺点优点：1、强大的分泌功能2、产物可正确折叠(天然构象+生物活性)3、非病原菌，无内毒素，被美国FDA认定为GRAS系统4、分子遗传学背景清楚，繁殖迅速，培养简单缺点：同源蛋白表达高（g/L)、异源蛋白低(mg/L)1、两类复制子：①金黄色葡萄球菌型复制子，如pUB110、pC194和pE194；②短小芽孢杆菌型复制子，如pHY481和pWT481。A、来源于金黄色葡萄球菌pUB110的复制子。特点：拷贝数高，但不稳定。B、来源于短小芽孢杆菌pWT481的复制子。特点：拷贝数低，但稳定。B芽孢杆菌的克隆载体系统2、异源启动子：大肠杆菌系统的启动子结构与芽孢杆菌的高度相似，异源启动子有效。可诱导型操作子：A.大肠杆菌的lac系统，包括lacI阻遏蛋白编码基因B.λ或φ105噬菌体的操作子区及温度敏感型阻遏蛋白基因C.枯草芽孢杆菌蔗糖可诱导基因sacB的调控序列3、表达质粒载体的可调控性：枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis)短小芽孢杆菌（Bacillusbrevis)地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis)C芽孢杆菌的宿主系统（1）枯草芽孢杆菌A、具强大的分泌能力（蛋白酶和淀粉酶分泌系统）B、大量分泌胞外蛋白酶，不利于产物积累碱性蛋白酶（aprA）、中性蛋白酶A和B（nprA、nprB）、金属蛋白酶（mpr）、胞外蛋白酶（epr)、杆菌肽酶F（bpf）。策略：敲除6种胞外蛋白酶编码基因+PMSF（2）短小芽孢杆菌A、分泌的胞外蛋白酶少B、强大的分泌能力（胞壁蛋白分泌系统）C、独特的细胞壁结构：*3层，外壁（OW）和中壁（MW）为蛋白胞壁，内层为肽聚糖胞壁。*胞壁蛋白OWP和MWP在细胞生长进入稳定期后大量脱落，并诱导各自大量分泌表达，于胞外大量积累。（3）地衣芽孢杆菌A、分泌的胞外蛋白酶少B、形成的芽孢少C、强大的分泌能力D、易转化：天然细胞（感受态、接合反应、原生质体、电转化）D芽孢杆菌的转化系统1、选择标记Em(红霉素)、Kan(卡那霉素)、Tc(四环素)、Cm(氯霉素)、Neo(新霉素)等抗性基因。2、转化方法①碱金属离子转化法通过K+或Cs+诱导外源DNA分子转化，其转化率可达103-104/μgDNA。②电穿孔转化法适用于大多数的细菌，转化率达104-106/μgDNA。转化率在很大程度上取决于电转的操作条件。③感受态法④原生质体法1、短小芽孢杆菌胞壁蛋白操纵子调控元件中壁蛋白（MWP）和外壁蛋白（OWP）基因组成一个操纵子（cwp），其5’端（0.6kb)基因表达调控序列（由启动子、SD序列、翻译起始位点和分泌信号肽编码序列组成）可用于外源基因的分泌表达。调控机制：完整的胞壁阻遏转录，生长稳定期胞壁蛋白的脱落和介质中低浓度的Mg++诱导（去阻遏）分泌表达E芽孢杆菌的分泌表达系统MWPMWPOWPmRNAOWPgeneproteinMWPMWPOWPmRNAOWPgeneprotein对数生长期稳定期短小芽孢杆菌胞壁蛋白的分泌OWMWPG短小芽孢杆菌胞壁蛋白操纵子MWP：短小芽孢杆菌胞壁蛋白操纵子基因5’端（0.6kb)，含启动子、SD序列、翻译起始密码子与信号肽序列。Ori:来源于金黄色葡萄球菌pUB110的复制子。拷贝数高，但不稳定。Emr：红霉素抗性基因2、枯草芽孢杆菌胞外果聚糖酶操纵子调控元件操纵子由果聚糖酶基因（sacB）的启动子PsacB、上游正调控序列DegQ和SacU、下游终止子样阻遏序列和抗终止蛋白SacY基因组成。PsacB：枯草芽孢杆菌胞外果聚糖酶基因启动子，受蔗糖诱导,上游有正调控元件degQ/sacUTerminator-like:终止子样结构，抑制PsacB启动，抗终止蛋白sacY可解除其作用。sacB-leader：分泌信号肽F重组芽孢杆菌在昆虫毒素蛋白生产中的应用1、苏云氏芽孢杆菌的遗传学特性苏云氏芽孢杆菌（BT）：内生芽孢、革兰氏阳性、土壤细菌芽孢形成初期合成杀虫蛋白晶体晶体在芽孢成熟细胞裂解后被释放到环境中对其敏感的昆虫一旦摄入这种晶体蛋白，1-5h便会死亡。安全无污染的高效生物杀虫剂：鞘翅目、鳞翅目、双翅目、直翅目昆虫，动植物寄生线虫，鞭毛虫，变形虫，吸虫、绦虫等。SHSHSHSH130kD亚基碱性蛋白酶碱处理伴孢晶体巯基乙醇还原250kD亚基的毒素原68kD的有活性毒素2、抗昆虫晶体蛋白的性质及其作用机理某些苏云氏芽孢杆菌菌株能同时合成多种不同的杀虫蛋白组分，这些不同的组分对应不同的杀虫谱，基本上可以分为5大类，分别命名为cryI、cryII、cryIII、cryIV、cryV基因。科学家利用苏云氏芽孢杆菌的杀虫晶体蛋白在植物生产上还培育出了抗虫棉。（1）将枯草芽孢杆菌的初级代谢启动子取代杀虫蛋白基因的自身启动子（全程表达）。（2）将多种杀虫蛋白基因嵌合在一起进行融合表达，以构建对抗多种害虫的多价工程菌。（3）通过基因定向突变技术改变杀虫蛋白的氨基酸序列，以增强杀虫蛋白的毒性作用，扩展杀虫选择范围。3、重组苏云氏芽孢杆菌的构建链霉菌的基因工程A链霉菌的生物学特征B链霉菌的载体克隆系统C链霉菌的宿主转化系统D链霉菌的基因表达调控系统E链霉菌的蛋白分泌系统F利用DNA重组技术改良抗生素生产菌革兰阳性、好氧、丝状、原核细菌生长周期：孢子发芽、营养菌丝和气生菌丝形成、孢子生成具有完善的代谢和分泌系统，能够分解大多数稳定的生物多聚物以及一些人工合成的高分子化合物丰富的次级代谢途径以及初级代谢与次级代谢之间的严密调控体系60％以上抗生素由链霉菌合成A链霉菌的生物学特征B链霉菌的载体克隆系统链霉菌的野生型质粒：天蓝色链霉菌可转移性因子SCP2*(3lkb)：l-2个拷贝变铅青链霉菌非转移性质粒pIJ101(8.9kb)：40-300个拷贝两种质粒的复制子是相容性、不存在任何同源序列变铅青链霉菌66株+天蓝色链霉菌A3(2)株=接合后者染色体DNA的一段序列转入接合受体菌SLP1.2（4-5个拷贝）链霉菌的克隆表达质粒大多数以SCP2*、pIJ101、SLP1.2为模板构建①pIJ702pIJ101衍生质粒、高拷贝复制,不易丢失、5.65kb、40-300拷贝非接合特性：鸟枪法克隆外源基因的载体，装载量10kb硫链丝菌素抗性筛选转化子+不产黑色素的白色克隆即为重组子(tsr+、mel-)②pIJ61pIJ61：质粒SLPl.2复制子、14.8kb、装载量比pIJ702大，拷贝数较少aph：氨基糖苷类抗生素(链霉素等)磷酸化失活具有典型的致死接合遗传标记---Ltz+；转化子--凹陷菌落--生长受到限制③pIJ922pIJ922：24kb、接合型质粒、SCP2*复制子、1-2拷贝标记：Ltz+、tsrEcoRⅤ克隆位点：凹陷菌落--转化子、硫链丝菌素敏感--重组子④pIJ699pIJ699：9.6kb、pIJl01复制子5.0kb+p15A大肠杆菌复制子4.6kb、穿梭载体质粒筛选标记：链霉菌硫链丝菌素抗性tsr、大肠杆菌紫霉素抗性基因vph和新霉素抗性基因neo空载的质粒，形成两个反向终止子结构，不能稳定复制，插入一段大于50bp的DNA片段可控制这种不稳定性⑤pIJ486／487pIJ486／487：启动子探针质粒、以pIJ702为基本框架、l00-200拷贝两者区别：新霉素抗性基因上游的多克隆位点MCS序列相反报告基因：新霉素抗性neo插入片段有无启动子活性：检测重组克隆的卡那霉素抗性水平⑥pKC796pKC796：不含链霉菌复制子的整合型质粒、链霉菌温和型噬菌体+大肠杆菌质粒pKC787重组克隆转化大肠杆菌筛选重组子(Amr、lacZ’)转化链霉菌整合筛选attp：特异性整合位点KC噬菌体载体系列KC系列：用于链霉菌重组克隆系统的噬菌体载体组成：链霉菌ØC31温和型噬菌体DNA、大肠杆菌质粒pBR322、链霉菌标记基因、attp特异性整合位点、噬菌体溶原维持的c基因温度敏感型的c突变基因(cts)---热诱导方法转入溶菌循环插入片段大小1.5-6.0kbC链霉菌的宿主转化系统1、原生质体转化法2、原生质体转染法3、完整菌丝体转化法变铅青链霉菌受体菌：变铅青链霉菌66株及其衍生物株---理想、应用广泛特点：不含内源型质粒、遗传背景清楚、易于质粒的转化操作、对外源DNA无明显的限制修饰作用能识别绝大多数链霉菌的启动子和终止子、能高效表达众多革兰氏阳性和阴性菌的基因拥有高效率的异源蛋白分泌系统1、原生质体转化法原生质体制备34%蔗糖的YEME培养基培养收集菌丝体10%的蔗糖溶液洗涤1mg/ml溶菌酶+P缓冲液悬浮30℃保温15-60min差速离心或过滤原生质体P缓冲液悬浮至1010/m1密度-70℃下过夜去冰块，-70℃保藏备用转化操作关键：加入DNA之前原生质体的洗涤、DNA与原生质体混合后，PEG缓冲液的迅速加入1ml原生质体离心去P缓冲液依次加入离心除去上清液1ml新鲜的P缓冲液悬浮原生质体涂布在R2YE再生平板30℃培养过夜1.连接反应液2.100ul含25%PEG1000的T缓冲液或P缓冲液3.1ml的P缓冲液筛选转化子原生质体转化转化率：106-107/ugcccDNA2、原生质体转染法噬菌体DNA以脂质体形式转染原生质体操作方法：缩醛磷脂酰胆碱+十八胺溶于氯仿旋转蒸抽去溶剂加入G缓冲液剧烈振荡室温下旋转蒸发数分钟加入KCl乙醇水溶液(乙醇：水＝1：10)室温下离心沉降悬浮液即为脂质体制备物原生质体离心去P缓冲液均匀悬浮加噬菌体DNA+脂质体悬浮液混合迅速加入PEGl000室温1min涂R2YE再生平板孢子覆盖30℃保温l8-24h噬菌斑计数和筛选转染率：线型DNA----5×107噬菌斑/ugDNA，连接液---降低1000倍3、完整菌丝体转化法TK23株受体+pIJ702供体感受态制备：菌YEME培养基+EDTA30℃培养50h收集菌丝体转化：菌丝体PEG4000+CsCl+MnCl2悬浮加入质粒DNA42℃保温5min涂布MpⅡ固体培养基27℃扩增26h影印含硫链丝菌素的MpⅡS培养基培养lh移去MPⅡS27℃培养l-2天转化率：103/ugDNAD链霉菌的基因表达调控系统1、启动子2、终止子3、核糖体结合位点4、密码子5、基因表达的反式调控元件1、启动子启动子序列多样启动子-10区和-35区之间的间隔区长度对启动子活性影响显著启动子-10区和-35区的序列对启动子活性也有影响获取强启动子：启动子探针质粒筛选、野生型启动子定向诱变与改造2、终止子终止子结构特征：较长的不完全互补的反向重复序列与大肠杆菌的σ因子依赖型终止子结构相似，能形成发夹结构终止位点位于终止子结构的下游邻近区域高效表达：选择强终止子结构、安装串联双终止子3、核糖体结合位点保守序列为：(a/g)-G-G-A-G-G，保守程度比其他G+细菌低高效表达：不要求SD序列与16srRNA3’端序列有很强的互补性链霉菌基因的转录起始位点与编码区之间的距离存在着很大的差异现象：转录起始位点与翻译起始密码子重叠，即mRNA分子上不存在5’端非翻译区---明显有别于其他原核细菌基因结构（启动子-转录起始位点-核糖体结合位点-翻译起始密码子）4、密码子密码