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动物疫病免疫抗体血清学检测方法2019.5.10内容一、血清学检测的意义二、血清学检测内容和方法三、血凝和血凝抑制实验四、酶联免疫吸附实验五、虎红平板凝集实验（初筛）一、血清学检测的意义动物免疫接种已经成为目前防御疫病传播的首选措施，只有给动物进行有效的免疫接种后，才能产生一定的保护力，从而防止疫病的侵入和蔓延。因此在群体接种疫苗前后对抗体水平进行检测，准确了解动物疫病发生、传播和流行情况，掌握畜禽免疫抗体水平和动物疫病保护情况，从而更有效地采取综合防控措施。因此，做好动物免疫抗体检测工作有着十分重要的临床意义和经济意义。重要性有效预防动物疫情的发生动物疫情普遍存在传染性，容易扩散，当发生动物疫情时，动物免疫抗体的监测，能够让我们了解疫情发展的情况，能够对控制疫情起到积极作用有效判断动物疫情发生的原因动物免疫抗体监测，能够为疫情发生时提供有效的数据，在第一时间找到疫情原因，有针对性的做出疫情控制。有效推动动物免疫程序的制定动物免疫抗体检测能够提供科学依据，让兽医技术人员有效的根据监测数据制定出免疫程序，有效的预防动物疫情，从而降低养殖户的经济损失二、血清学检测内容和方法猪猪瘟O型口蹄疫A型口蹄疫牛O型口蹄疫A型口蹄疫羊O型口蹄疫小反刍兽疫禽禽流感新城疫检测内容检测方法禽流感：（H5+H7）三价灭活疫苗（H5N1Re-8株+H7N9H7-Re1株）——2019鸡新城疫血凝与血凝抑制实验猪瘟O型口蹄疫A型口蹄疫地方病：蓝耳、细小、圆环、伪狂犬、乙脑小反刍兽疫酶联免疫吸附实验ELISA布病虎红平板凝集实验（初筛）血凝试验：某种病毒的血凝素，能使鸡、鹅或人的红细胞发生凝集，叫做血凝试验，也称直接血凝反应，利用这种特性设计的试验称血凝试验(HA)。常见于正粘病毒（禽流感）、副粘病毒（新城疫）和某些黄病毒、痘病毒等。目的：测定病毒的血凝效价，通常采用4个血凝单位用已知抗原来检测被检血清中有无相应的特异性抗体和滴定该特异性抗体的水平。三、血凝与血凝抑制实验（禽流感和鸡新城疫）血凝素（HA）柱状刺突：亚型特异性抗原，易变异血凝素（HA，从H1—H15):呈柱状功能：①吸附细胞：与细胞上受体结合,使病毒侵入细胞②凝集多种动物的红细胞（血凝试验）③具抗原性：其抗体能中和病毒---中和抗体抑制血凝（血凝抑制试验）血凝素（HA）柱状血凝试验（HA)原理：血凝抑制试验：当病毒的悬液中先加入特异性抗体，且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或其血凝素直接接触。这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制反应，也称血凝抑制反应，利用这种特性设计的试验称血凝抑制试验(HI)。该试验是目前WHO进行全球流感监测所普遍采用的试验方法。目的：检测有无病毒感染和免疫状态。血凝抑制试验（HI）原理病毒的悬液中加入特异性抗体，红细胞的凝集现象被抑制，称为红细胞的血凝抑制。？++主要实验器材：微量移液器○普通离心机微量振荡器禽用采血器96孔V型血凝反应板试验主要试剂：标准抗原、阳性血清、阴性血清与待检血清1%鸡红细胞悬液（阿氏液）生理盐水（PBS液）四单位抗原阿氏（Alsevers）液配制称量葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸0.055g、氯化钠0.42g，加蒸馏水至100mL，散热溶解后调pH值至6.1，69kPa15min高压灭菌，4℃保存备用。1%红细胞的配制1.准备好试验所需的所有材料，包括离心管、低速离心机、试管架、PBS缓冲液（生理盐水）、注射器、100ml大青瓶及塞子等等。2.抗凝血第一次离心。用注射器采集若干毫升抗凝鸡（鸭）血，根据需要确定。将抗凝血缓慢注入离心管内，盖好盖子后将离心管放入离心机，配平后1500r/min离心5min，离出抗凝剂及血浆等。1%红细胞的配制3.第一次离心结束后，将上层液体及白细胞层用注射器吸出，加入适量PBS缓冲液，配平后进行第二次离心，1500r/min离心5min，进一步清洗红细胞。4.第二次离心结束后，同样吸出上层液体及白细胞层，再加入适量PBS缓冲液，配平后进行第三次离心，2000r/min离心10min，进一步清洗红细胞。5.离心结束，最后一次吸出上层清液。量取99mlPBS缓冲液加入100ml大青瓶（或其他容器），用注射器（或其他，如吸管）吸取1ml洗净的红细胞，缓慢加入99mlPBS缓冲液中，塞紧瓶塞。注意：在加红细胞过程中还须不断轻摇以确保红细胞均匀，使其每孔加入相同数量的红细胞。制备好的红细胞液如果放置后上清液变红，说明有溶血，不可再使用。倒加血凝试验操作步骤结果判定血凝反应强度示意图“4＋”红细胞呈片状凝集，均匀布满孔底，边缘有时不整齐或皱缩。“3＋”红细胞呈片状凝集，但面积略小于“4+”。“2＋”红细胞呈片状凝集，但有少许沉积孔底中部呈小圆点状。“＋”红细胞大部分沉于孔底中央，周围有少量散在凝集颗粒。“－”红细胞均沉于孔底呈小圆点状，边缘整齐。2.对照孔正常的情况下，红细胞凝集100%的稀释度为判定血凝价的终点。凡能使鸡红细胞完全凝集的病毒最高稀释倍数为病毒的凝集价。血凝试验操作步骤4个100%血凝单位（即4HA100）抗原的稀释倍数=使100%红细胞凝集的抗原最高稀释倍数/4四单位抗原是血凝抑制试验的重要环节，其准确性对试验结果有重要的影响。抗原浓度高时，HI抗体效价就会降低；反之则会有所升高。抗原效价测量是否准确，决定了配制而得的四单位抗原准确性。血凝抑制试验操作步骤血凝抑制试验结果判定以完全抑制红细胞凝集的血清最大稀释度为该血清的HI滴度（注：看结果时96孔板倾斜45度）。确定度数的孔要与前一孔的流速及形状完全一样，即泪珠样流挂。读数要快，可以读到结束，一组（一板）时间不要超过30秒。禽流感：免疫21天后HI抗体效价≥4为免疫合格鸡新城疫：免疫21天后，抗体效价≥5判定为合格酶联免疫吸附试验（ELISA）概述酶联免疫吸附试验（ELISA）操作流程全自动酶免工作站四、酶联免疫吸附实验（ELISA）酶联免疫吸附试验（ELISA）概述酶联免疫吸附试验，简称ELISA，是实验室最常用的检测方法。酶是能够催化化学反应的特殊蛋白质，其催化效力超过目前所有人造催化剂。酶标记抗原或抗体以后，既不影响抗原抗体反应的特异性，也不改变酶本身的活性。因此ELISA具有准确性高、检测时间短、价格低廉、判断结果有客观标准、结果便于记录和保存等优点，适合于大批标本的检测，广泛应用于食品安全检测、医疗检测以及免疫实验分析等领域。间接ELISA基本原理其原理是将抗原连接到固相载体上，样品中待测抗体与之结合成固相抗原受检抗体复合物，再用酶标二抗（针对受检抗体的抗体）与固相免疫复合物中的抗体结合，形成固相抗原-受检抗体-酶标二抗复合物，可用目测或用分光光度计定量测定加底物后的显色程度，确定待测抗体含量。实验准备微量移液器○酶标仪烘箱吸水纸诊断试剂举例：间接ELISA检测猪瘟病毒抗体试验样品、标准品以及试剂准备加样孵育洗板显色比色结果分析各种类型ELISA测定时一般需经过这些步骤：加待测样品→温育→洗涤+加酶标物→温育→洗涤→加底物→温育一加终止液→比色→判定结果。试剂盒从冷藏环境中取出时，必须平衡至室温后，方可开封启用。注意的关键点是：加样不可太快，要避免加在孔壁上部，不可溅出和产生气泡。加样太快，无法保证微量加样的准确性和均一性。加在孔壁上部的非包被区，易导致非特异吸附。溅出会对邻近孔产生污染。出现气泡则反应液界面有差异。ELISA的比色测定主要由酶标仪进行。此处强调以下几点：（1）酶标仪不应安置在阳光或强光照射下，室温宜在15－30℃，使用前先预热仪器15－30分钟，测读结果更稳定。各种酶标仪性能不同，使用前应详细阅读说明书。（2）比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体，然后将板正确放入比色架中，以免锈蚀酶标仪比色架。（3）比色测定时，一定要注意酶标仪的波长是否已调至合适或所用滤光片是否正确。未来：全自动酶免工作站1、加样模块2、孵育模块3、洗板模块4、读数模块5、控制模块（软件）全自动--从加样、孵育、洗涤到数据处理打印报告都由仪器自动完成；无污染--直接使用原样本试管和原试剂瓶，消除生物污染和试剂污染；高效率--一次性处理样本量大；使用全自动酶免可以：*提高加标本速度与效率*减少操作人员劳动强度*使标本传染操作人员机会最小化*通过减少人为失误和改善加样精确度与准确性来改善检测分析质量；*采用批量（batch）或随机（randomaccess）进行多种组合与多种模式检测未来：全自动酶免工作站五、虎红平板凝集实验（初筛）——布鲁氏菌病材料准备抗原、标准阳性血清、阴性血清由制标单位提供，按说明书使用受检血清应新鲜，无明显蛋白凝块，无溶血和腐败气味虎红平板凝集反应纸吸头，适用于滴加0.03ml牙签或火柴杆，供搅拌用操作方法将虎红平板纸上加相应血清0.03ml。在受检血清旁滴加抗原0.03ml。用牙签类小棒搅动血清和抗原使之混合。每次试验应设阴、阳性血清对照。判定在阴、阳性血清对照成立的条件下，方可对被检血清进行判定。受检血清在4min内出现肉眼可见的凝集现象者判为阳性（+），无凝集现象，呈均匀粉红色者判为（-）。Loremipsumdolorsitamet,consecteturadipisicingelit.非常感谢您的聆听